DEL I: Patogen IDENTIFIKATION 1. Prøvefremstilling Bemærk: Hele molekylære arbejdsgangen, som er beskrevet i det følgende protokol skal udføres i henhold til anbefalinger for kvalitetssikring inden for molekylær diagnostik 3. Tilsættes en 0,1 ml alikvot blod kultur til 0,9 ml 0,9% NaCI til en 1,5 ml reaktionsrør for at blive en 1:10 fortyndet prøve. (Fortyndet for at forhindre qPCR inhibering). Centrifugeres prøven ved 13.400 x g i 5 min for at pelletere den bakterielle DNA. Resuspender den bakterielle pellet i 100 ul sterilt demineraliseret H2O Opbevares DNA-prøven ved 4 ° C indtil yderligere anvendelse. 2. Identifikation Assay: Real-time 16S rDNA-PCR Forberede reaktionsblandinger som følger. Assayet består af fire separate reaktioner pr prøve. Hver blanding omfatter 12,50 gl førerblanding, 0,9 uM fremadrettet primer (5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3) 7, 0,6 uM revers primer (5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3) 8 og et panel af prober. Mængden af prober er givet for hver af de fire separate reaktioner i det følgende. Den første reaktion omfatter: 0,2 uM universal probe (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 8 0,2 uM P. aeruginosa probe (5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1) Den anden reaktion omfatter: 0,2 uM E. coli probe (5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1) 0,2 uM Pseudomonas spp. probe (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ) Den tredje reaktion omfatter: 0,2 uM Staphylococcus spp. probe (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ) 0,2 uM S. aureus probe (5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1) 0,2 uM Enterococcus spp. (5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1) Den fjerde reaktion omfatter: 0,2 uM universal probe (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 0,3 uM Streptococcus spp. probe (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ) 0,2 uM S. pneumoniae-probe (5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1) Tilsættes sterilt demineraliseret H2O for at opnå en samlet volumen på 20 ul. Tilsættes 20 ul af hver reaktionsblanding til brøndene i en 96-brønds PCR-plade. Tilsættes 5 ul prøve til hver brønd. Anvender en klæbende film til at forsegle 96-brønds PCR-plade. Køre pladen på ABI PRISM 7900HT Real Time PCR System under anvendelse af følgende optimale termiske cyklusforhold: Forvarmning ved 50 ° C i 10 minutter Indledende denaturering ved 95 ° C i 15 min 42 cykler af Denaturering ved 95 ° C i 15 s Annealing ved 60 ° C i 1 minut 3. Analyse af resultater Juster tærsklen til det Ct Analyse til 0,1 i fanen Analysis Indstillinger. Begræns de grundlæggende konfigurationer at starte (Cycle): 6 og End (cyklus): 15. Registrere cyklus tærskelværdien (Ct) værdi for alle prøver. Cut-off værdi til at behandle en PCR-resultat som positiv kan indstilles til en Ct-værdi på 35. Mængden af bakterier i blodkulturer varierede fra juli 10 – November 10 CFU / ml, genererer CT-værdier under 35. DEL II: ANTIBIOTIKUM Susceptibility Testing 4. Isolering af bakterier fra positive blodkulturer 9 Aspirer 5 ml bouillon fra en positiv blodkultur flaske og overføre det til et serum separator rør. Centrifugeres serum separatoren røret ved 2000 xg i 10 minutter. Supernatanten fra serum separatoren røret. Overførsel BACterier fra gelen lag af røret med en steril vatpind til 0,9% saltvand, indtil en 0,5 McFarland standard suspension. 5. Podning af Micro titre plader Fortynd 0,5 McFarland suspensionen i dobbelt koncentreret Mueller Hinton II bouillon til dannelse af en suspension af 5 x 10 5 CFU / ml. Tilføje denne suspension til brøndene i en mikro-titer plade indeholdende et udvalg af antibiotika (tabel 1). Inkubér mikro-titer pladen ved 37 ° C i 6 timer. Opbevares en portion af suspensionen ved 4 ° C (som negativ vækst kontrol). Efter 6 timers inkubation, overføre indholdet af hver brønd i en steril slange, såvel som en negativ vækst kontrolprøve, der blev opbevaret ved 4 ° C. Centrifuger rørene ved 16000 xg i 5 min. Forsigtigt fjernes supernatanten, uden at forstyrre den bakterielle pellet. Pellet resuspenderes i sterilt demineraliseret H <sub> 2 O. Fortyndes prøverne 10 gange i sterilt demineraliseret H2O 6. Real-time 16S rDNA-PCR 10 Fremstille PCR-blandingen som følger: 12,50 gl iQ SYBR Green Supermix 0,5 uM fremadrettet primer 16S-en (5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) 11 0,25 um reverse primer 16S-2-(5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) 11 sterilt demineraliseret H2O til et samlet volumen på 20 ul Tilsættes 20 ul PCR-blanding til brøndene i en 96-brønds PCR-plade. Tilsættes 5 ul prøve til hver brønd. Anvender en klæbende film til at forsegle 96-brønds PCR-plade. Kør pladen på MyiQ Single-Color Real-Time PCR Detection System, ved hjælp af følgende optimale termiske cyklisternes forhold: Indledende denaturering ved 95 ° C i 4 min Første annealing ved 65 ° C i 30 s 35 cykler af Denaturering ved 95 ° C i 15 s Annealing ved 60 ° C i 1 minut Smelte kurveanalyse (fra 60-95 ° C i 20 minutter med inkrementer på 0,57 ° C) 7. Analyse af resultater Beregn cut-off Ct værdi ved hjælp af en af de følgende formler (afhængigt af typen af antibiotika). Generelt: Cut-off Ct værdi = Ct værdi positiv vækst kontrol + 0,5 x (Ct værdi negativ vækst i kontrol – Ct værdi positiv vækst kontrol) Piperacillin, piperacillin / tazobactam og ceftazidim i Gram-negative stave, Amoxicillin, oxacillin og trimethoprim / sulfamethoxazol i S. aureus, Amoxicillin i Enterococcus spp. Cut-off Ct værdi = Ct værdi positiv vækst kontrol + 0,25 x (Ct værdi negativ vækst kontrol – Ct værdi positiv vækst kontrol) Brug prøven inkuberes med sterilt demineraliseret H 2 O som en positiv vækst kontrol. Afhængigt af mikroorganismen, i modsat fald vækstkontrol anvende: Gram-negative stave prøve inkuberet med en blanding af antibiotika Enterococcus spp. Prøve opbevaret ved 4 ° C S. aureus prøve opbevaret ved 4 ° C Bestemme modtageligheden (S) eller modstand (R) af stammen for den testede antibiotika som følger: En CT-værdi højere end cut-off Ct værdi indikerer modtagelighed En CT-værdien er lavere end cut-off Ct værdi indikerer modstanden 8. Repræsentative resultater To modelorganismer, dvs en Gram-negativ E. coli og en Gram-positiv S. aureus, er valgt til at visualisere den kombinerede procedure til påvisning og identifikation af bakterielle patogener og bestemmelse af deres antimikrobielle profil. Den første del af protokollen omfatter patogenet identifikation. Specifikke prober designet til detektion af otte klinisk relevante mikroorganismer. I nærvær af et mål indeholdt i den bakterielle panelet er amplifikationsprodukter kurverne frembragt og Ct-værdier beregnes (figur 2). Cut-off værdi til at behandle en PCR-resultat som positiv sættes til en Ct-værdi på 35. I figur 2A er identifikationen profilen af en E. coli-inficeret blod kultur vist. Den 16S universelle Sonden er inkluderet i to separate reaktionsblandingerne og dermed genererer to forstærkning kurver (Ct på 25,20 og 25,95). Det tredje signal afledes fra proben er specifik for E. coli (Ct i 27,04). Identifikation af en S. aureus-inficeret blod kultur er vist i figur 2B. 16S universelle probe har amplifikationsprodukter signaler 33,35 og 33,71. De to resterende signaler afledt af prober specifikke for Staphylococcus spp. og S. aureus (Ct på 32,48 og 30,59). <p class = "jove_content"> Efter den første del af protokollen, er den kausale mikroorganisme kendt, og det antimikrobielle profil kan bestemmes. Figur 3 er et eksempel på et antibiotikum følsomhedstest forstærkning plot, der repræsenterer E. coli-stammen, der blev også vist i figur 2A. Hver linje repræsenterer et antibiotikum, at bakterieprøven blev inkuberet med. En prøve med en lav Ct-værdi er en prøve, hvis vækst forekom i nærvær af et antibiotikum, der angiver resistens til det testede antibiotika. Tværtimod repræsenterer en høj Ct værdi en prøve, hvori ingen vækst er sket på grund af den effektive bearbejdning af antibiotika, hvilket indikerer modtagelighed for den testede antibiotika. Tabel 1 illustrerer bestemmelsen af den antimikrobielle profil E. coli og S. aureus-isolater. Alle Ct-værdier er rapporteret, og ved hjælp af de formler, der er nævnt i protokollen teksten (7,1), to cut-off Ct-værdier opgøresberegnes til at skelne mellem modstand og følsomhed. Stammen er resistent over for antibiotika, hvis den rapporterede Ct er lavere end det beregnede cut-off Ct værdi (og vice versa). Figur 1. Rutediagram af patogenet identifikation og antibiotikum følsomhedstest procedure under anvendelse tidstro 16S rDNA PCR. Figur 2 Identifikation analysen:. Amplification plots og cykelstier tærskelværdier (Ct-værdier) Et positivt blod kultur er opdaget af den universelle 16S rDNA sonde, mens de specifikke prober anvendes til identifikation af kausale patogener.. A. amplifikation afbildning af blod kultur indeholdende E. coli B. amplifikation afbildning af blod kultur indeholdende S. aureus, Pseu ae, Pseudomonsom aeruginosa, uni, 16S universelle probe; Ecoli, Escherichia coli probe, Pseu sp, Pseudomonas spp. probe, S. pneu, Streptococcus pneumoniae-probe, Strep sp, Streptococcus spp. probe, entero, Enterococcus spp. probe, S. aureus, Staphylococcus aureus probe, Staph sp, Staphylococcus spp. probe. Figur 3. Amplifikation afbildning af antibiotikum følsomhedstest af en E. coli isolat (prøve 1). Hver kurve repræsenterer et antibiotikum, at stammen blev inkuberet med. Et tidligt signal er forårsaget af en høj bakteriel belastning, hvilket betyder, at stammen er vokset i nærvær af den testede antibiotika og er således resistente over for antibiotika. Sene signaler angiver, at stammen ikke er dyrket i nærværelse af antibiotikum, med andre ord er den modtagelig. <tbody> Prøve 1: E. coli Prøve 2: S. aureus AST Ct R / S AST Ct R / S Amoxicillin 8 mg / L 16,83 R Amoxicillin 0,25 mg / L 21,03 R Amoxicillin-clavulanat 8/4 mg / L 17,36 R Oxacillin 2 mg / L 25,80 S Piperacillin 16 mg / L 16,67 R Vancomycin 2 mg / L 25,20 S Piperacillin-tazobactam 16 /4 mg / L 24,15 S Gentamicin 4 mg / L 25,86 S Ciprofloxacin 1 mg / L 29,72 S Trimethoprim-sulfamethoxazol 2/38 mg / L 24,62 S Ceftazidim 1 mg / L 24,03 S Ceftazidim 8 mg / L 26,58 S Gentamicin 4 mg / L 29,83 S Trimethoprim-sulfamethoxazol 2/38 mg / L 27,60 S Negativ vækstkontrol (blanding af antibiotika) 30,41 Negativ vækst kontrol (prøve opbevaret ved 4 ° C) 27,42 Positiv vækstkontrol 16,90 Positiv vækstkontrol 20,22 Cut-off Ct-værdi 1 * 21,76 Cut-off Ct-værdi 1 *** 23,82 Cut-off Ct-værdi 2 ** 18,75 Cut-off Ct-værdi 2 **** 22,02 * For amoxicillin, amoxicillin-clavulanat, ciprofloxacin, gentamici, trimethoprim-sulfamethoxazol ** For piperacillin, piperacillin-tazobactam, ceftazidim *** For vancomycin og gentamicin **** For amoxicillin, oxacillin og trimethoprim-sulfamethoxazol Tabel 1. Bestemmelse af antibiotika følsomhedstest af de to prøver (E. coli og S. aureus). Ct-værdier for PCR-assayet blev kopieret til denne excel fil, som der kan automatisk beregner de to afskårne Ct alues fra de positive og negative vækstkontrol, ved hjælp af formlerne vist i protokollen teksten. Hvis et antibiotikum viser et Ct-værdi lavere end cut-off Ct værdi, er resistent over for antibiotikummet, hvis Ct-værdien var større end cut-off stammen er modtagelige.