Visualisering af DNA-replikation i hvirveldyr modelsystem DT40 ved hjælp af DNA-Fiber Teknik

Summary

DT40, en model hvirveldyr genetiske system, giver et kraftfuldt værktøj til at analysere proteinernes funktion. Her beskriver vi en simpel metode, der giver mulighed for kvalitativ analyse af de parametre, der påvirker DNA-syntesen i S-fase i DT40 celler på enkelt molekyle niveau.

Abstract

Vedligeholdelse af replikationsgaffel stabilitet er af største betydning for celledeling at bevare bæredygtighed og forebygge sygdomme. De involverede processer ikke blot sikre trofaste genom dobbeltarbejde i ansigtet af endogene og eksogene DNA-skader, men også forebygge genomisk ustabilitet, en anerkendt årsagsfaktor i tumor udvikling.

Her beskriver vi en enkel og omkostningseffektiv fluorescens mikroskopi-baserede metode til at visualisere DNA-replikation i den aviær B-cellelinie DT40. Denne celle linie giver et kraftfuldt værktøj til at undersøge proteinernes funktion in vivo ved omvendt genetik i hvirveldyr celler ^1. DNA fiber fluorography i DT40 celler mangler et bestemt gen gør det muligt at belyse funktionen af ​​dette gen produkt i DNA replikation og genom stabilitet. Traditionelle metoder til at analysere replikationsgaffel dynamik i hvirveldyr celler stole på at måle den generelle forekomst af DNA syntese i en population af puls-mærkede celler. Dette er en kvantitativ tilgang, og giver ikke mulighed for kvalitativ analyse af parametre, der påvirker DNA-syntesen. I modsætning hertil kan satsen bevægelighed af aktive gafler følges direkte ved brug af DNA-fibre teknikken ^2-4. I denne tilgang, er spirende DNA-mærket in vivo ved inkorporering af halogenerede nukleotider (Fig. 1A). Efterfølgende er de enkelte fibre strakt på et objektglas, og det mærkede DNA-replikation skrifter farves med specifikke antistoffer og visualiseres ved fluorescens mikroskopi (figur 1B). Initiering af replikation samt gaffel direktionalitet er bestemt af træk brugen af ​​to forskellige modificerede analoger. Desuden dual-mærkning tilgang giver mulighed for kvantitativ analyse af parametre, der påvirker DNA-syntesen under S-fasen, dvs replikering strukturer som igangværende og gået i stå gafler, replikering oprindelse tæthed samt gaffel opsigelser. Endelig kan den eksperimentelle procedure udretteed inden for en dag, og kræver kun almindelig laboratorieudstyr og en fluorescens mikroskop.

Protocol

Metoden beskrives her blev brugt i følgende publikation: Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5.. 1. DT40 cellekultur Materialer: føtalt bovint serum (FBS), kylling serum, penicillin / streptomycin, 2-mercaptoethanol, RPMI Forbered cellekulturmedium: Tilføj 7% FBS, 3% kylling serum, 1x penicillin / streptomycin og 10 ìm 2-mercaptoethanol til RPMI medium. DT40 celler dyrkes i sterile cellekultur kolber ved 38 ° C og 5% CO 2 i et befugtet kuvøse. Opdel celler hver dag til en tæthed på 5 x 10 5 celler / ml 6. 2. In vivo mærkning Materialer: IDU, CldU Forbered stamopløsninger af nukleotidanaloger: Opløs Idu til 5 mm og CldU til 2,5 mM i medium. Opvarm begge løsninger kortvarigt til 60 ° C og vortex indtil nukleotid analogdier er opløst helt. Tilføj IDU til en endelig koncentration på 25 μM til eksponentielt voksende DT40 celler og blande cellesuspension godt. Inkuber celler i 20 minutter ved 38 ° C og 5% CO 2. Efter inkubation med den første etiket, tilføje CldU til en endelig koncentration på 250 m og behandle celler, som beskrevet i det foregående trin. Vask cellerne med is kold PBS og resuspender dem ved en koncentration på 7,5 x 10 5 celler / ml i koldt PBS. Hold mærkede celler på is. Mærkningen beskrevne procedure er blot et forslag og kan ændres for at løse specifikke spørgsmål. Der henvises til diskussionen afsnittet for mere information om eksperimenterende design. 3. Cellelysis og DNA breder sig Materialer: Glas slides, fiber lysering løsning Forbered fiber lysering løsning: 50 mM EDTA og 0,5% SDS i 200 mM Tris-HCl, pH 7,5 <li> Spot 2 μl af cellesuspensionen til den ene ende af objektglas. Air-tørre i 5 minutter, eller indtil den mængde er faldet stærkt reduceret, men ikke tør. Pipette 7 μl lysis løsning på toppen af ​​cellesuspensionen og forsigtigt omrøres med pipettespidsen at blande løsninger. Inkuber i 2 minutter for cellelysis at fortsætte. Tilt dias til 15 °, så fibrene til at sprede langs diaset. Når fiber løsningen har nået bunden af ​​det dias, placer den vandret for at lufttørre. Efter tørring bør en tynd, uigennemsigtig linje være synlig langs dias. På dette tidspunkt, skal i starten af ​​den strakte fibre være mærket med en blyant som efter farvning linjen vil ikke være synlig længere. Dette mærke vil senere bidrage til at lokalisere fibrene under mikroskop. 4. Immunfluorescens farvning Materialer: Methanol, eddikesyre, HCl, 5% BSA i PBS, farvning jar, anti-BrdU (mus) antistof,anti-BrdU (rotte) antistof, får anti-mus Cy3 antistof, ged anti-rotte Alexa Fluor 488 antistof, Vectashield Mounting Medium, dækglas, neglelak Nedsænk objektglassene i methanol / eddikesyre (3:1) i en farvning krukke og inkuber i 10 minutter. Skyl objektglassene i destilleret H 2 O, og derefter fordybe i 2,5 M HCl i 80 minutter. Vask dias tre gange i PBS i 5 minutter. Fjern dias fra den farvning krukken og indsamle overskydende PBS med et stykke køkkenrulle. Placer dias vandret og pipette 5% BSA oven på hvert dias. Dæk slides forsigtigt med en dækglas at sprede BSA jævnt over slæden og inkuber i 20 minutter. Fortynd den primære antistoffer i 5% BSA på følgende koncentrationer: 1:25 anti-BrdU (mus) og 1:400 anti-BrdU (rotte). Flyt dækglasset forsigtigt ned i glasset diaset for at fjerne det. Du må ikke bruge magt, hvis låget glide klæber til diaset. Den side kan rehydreres i PBS, indtil dækglasset bliver løst end kan fjernes med lethed. Saml overskydende BSA med et stykke køkkenrulle og placer dias vandret. Afpipettér 50 μl af det primære antistof løsningen på de enkelte dias. Dæk igen med et dækglas at sprede antistof løsning jævnt over dias og inkuber i et befugtet kammer i 2 timer. Efter fjernelse af dækglas, skylles objektglassene tre gange i PBS i 5 minutter Fortynd den sekundære antistoffer i 5% BSA på følgende koncentrationer: 1:500 får anti-mus Cy3 og 1:400 gede anti-rotte Alexa Fluor 488. Anvend 50 μl af den sekundære antistof løsning som beskrevet for den primære antistoffer. Beskyt slides mod lys og inkuber i 1 time. Efter fjernelse af dækglas, skylles objektglassene tre gange i PBS i 5 minutter. Tilføj en dråbe Vectashield Mounting Medium på hvert dias og der sættes dækglas. Tryk forsigtigt dækglas og fjerne overskydende væske omkring det med et stykke køkkenrulle. Seal dækglas med gennemsigtige negle Polish og lad dem tørre. Opbevar dias ved -20 ° C. 5. Billede erhvervelse Materialer: fluorescens mikroskop, kamera Placer en dråbe nedsænkning olie på et dias tæt på blyanten mærket og begynde at lokalisere fibre. Typisk er der en primær fiberbundt, men disse fibre er for indviklet og kan ikke blive analyseret senere. Flyt væk fra de vigtigste bundt til at finde områder, hvor fibrene er klart adskilt fra hinanden (fig. 2). Vi ville vælge billeder kun ved hjælp af en farvekanal for at undgå bias. Så ville vi tage omkring 10 billeder af hvert tidspunkt, koncentration eller cellelinje. Antallet af billeder afhænger af, hvor mange fibre kan tælles på hvert billede. Bevæger sig langs slæden til at tage forskellige billeder, som et område af et dias ikke kan give repræsentative fiber længder eller replikation strukturer. 6. Dataanalyse <p class="Jove_content"> Materialer: Billede program til analyse, f.eks ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) Importer billeder ind i et billede program til analyse. Mål længden af ​​fiber skrifter og / eller tælle forskellige replikation strukturer (figur 3). Kun tælle fibre som tydeligt kan ses, og som ikke hænge ud over kanten af ​​billedet. Vi typisk måle længden af ​​omkring 100 fibre og tæller 150-200 replikation strukturer og vi ville gentage enkelte eksperimenter mindst tre gange. 7. Repræsentative resultater: Nyligt replikeres DNA kan visualiseres som linjer af antistof-mærket nukleotidanaloger. I vores eksperimenter løbende forgaffel er repræsenteret som tilstødende røde og grønne signaler (Figur 3). Den dobbelte mærkning Protokollen giver også giver os mulighed for at definere fire store klasser til at replikere strukturer: 1) nye indledning hændelser kan divid ed ind oprindelse, som har fyret, mens cellerne blev inkuberet med den første etiket og oprindelser, der har fyret under inkubation med den anden etiket. Den tidligere består af nabolandet grøn-rød-grønne signaler og den sidste af en grøn linje. 2) opsigelse begivenheder manifestere sig som tilstødende rød-grøn-rød-signaler. 3) afbrudt oprindelse er steder i genomet med tætsiddende oprindelse. Sådanne steder består af hinanden følgende oprindelse og terminering signaler. 4) afhængig af det eksperimentelle design, gået i stå / kollapsede gafler kan enten defineres som en rød eneste signal 7 eller en rød linje, efterfulgt af en kort grøn tarmkanalen 8,9. Brug de betingelser, der er beskrevet her, vildtype DT40 celler har en gennemsnitlig gaffel hastighed på 0,4 mm / min. Vi kan registrere cirka 63% løbende gafler, 10% oprindelse, 16% gået i stå gafler (rød kun skrifter), 8% afslutninger og 3% afbrudt fibre. URE 1 "/> . Figur 1 (A) Den venstre side af tegneserie skildrer det første trin i DNA-mærkning procedure: tilføje Idu til eksponentielt voksende DT40 celler fører nukleotid analog til let integreres i den nyligt syntetiserede førende og halter DNA-strenge. Dette kan visualiseres ved hjælp af et specifikt antistof, og vises som en rød linje, når ses under mikroskop. Efterfølgende er det samme procedure gentages med CldU som vist på højre side af figuren. Efter inkubation med det andet nukleotid analog, vil en aktiv gaffel være synlige som en tilstødende rød-grøn-tarmkanalen. Den gennemsnitlige fiberlængde er proportional med inkubationstiden for nukleotidanaloger. (B) dna fra lyserede DT40 celler er strakt ved hjælp af tyngdekraften på et objektglas og indarbejdet nukleotidanaloger visualiseres ved brug af specifikke antistoffer og fluorescens mikroskopi. IGUR 2 "/> Figur 2. Et repræsentativt fluorescens billede viser fibre fra vildtype DT40 celler efterfølgende mærket med Idu og CldU i 20 minutter hver. De fleste af fibrene er godt adskilt fra hinanden og kan derfor nemt analyseres. Den hvide søjle repræsenterer 10 ìm. . Figur 3 Den dobbelt-mærkning fiber teknik gør det muligt at skelne mellem forskellige replikation strukturer; 1 – aktivt at replikere gafler, 2 – nye områder af DNA-replikation (affyring af ny oprindelse), 3 – gaffel opsigelser (to konvergerende gafler), 4 – afbrudt af fibre (steder af tætliggende oprindelse) og 5 – gået i stå gafler (rød kun signal).

Discussion

Vi beskriver en metode, der giver mulighed for kvantitativ analyse af parametre, der påvirker DNA-syntesen i S-fase på et enkelt molekyle niveau. I løbet af de seneste ti år, var forskellige versioner af DNA fiber fluorography teknik udviklet til at visualisere den frie bevægelighed for enkelte replikation gafler i levende celler. Den kritiske parameter i alle disse teknikker er den procedure, der anvendes til at opnå den bedst mulige strækning af DNA på glasflader giver godt adskilt DNA-fibre. Et afgørende skridt for at opnå dette er inkubationstiden af ​​cellesuspensionen på objektglas samt lyse tid. Disse parametre afhænger af temperatur og luftstrøm i et bestemt laboratorium og bør bestemmes empirisk. Den praktiske del af en DNA fiber eksperiment er typisk realiseret i løbet af en dag. Men efterfølgende billede indsamling og analyse er mere tidskrævende og kræver øvelse.

Mærkningen protokol kan annonceApted at besvare forskellige videnskabelige problemer: ved hjælp af en agent, der interfererer med replikation i andet pulsen mærkning overvåger gaffel forlængelse / gået i stå som reaktion på replikation stress. I dette scenario er den første etiket ikke behøver at blive vasket ud som den anden nukleotid er tilføjet i overskud. Alternativt, kan medicin, der hæmmer replikation anvendes i kombination eller lige efter tilsætning af den første etiket. Dette kræver den første etiket, og stoffet, der skal fjernes, før den anden nukleotid analog anvendes. Denne procedure gør det muligt at bestemme betydningen af ​​forskellige DNA-reparation faktorer på replikation gaffel stabilitet / genopretning under forhold med replikation stress (dvs. gaffel stå og / eller kollaps). Bemærkelsesværdigt, kunne en mere detaljeret analyse af oplysninger om DNA-replikation programmet skal udføres med brug af en alternativ metoder, der kombinerer DNA kæmning og fluorescens in situ hybridisering. Dette er dog teknisk set mere udfordrende og kræver udgiftertende udstyr.

Evnen til at kvalitativt og kvantitativt analysere oplysninger om DNA-replikation giver et vigtigt redskab til at undersøge fejl i DNA replikation sig selv såvel som de veje, der undertrykker genomisk instabilitet i forbindelse med replikering gafler. Utvivlsomt vil denne analyse yderligere hjælpe med at kaste lys over de mekanismer til at replikere-medieret DNA-reparation, der tillader normale celler til at reagere / tilpasse sig miljøændringer, samt hvordan kræftceller udnytter disse mekanismer til at modstå toksiciteten af ​​lægemidler rettet mod replikation gafler.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Fetal bovine serum gold (FBS)	PAA	A15-151
Chicken serum	Sigma	C5405
Penicillin/Streptomycin	PAA	P11-010
RPMI 1640	Gibco	21875
5-Iodo-2′-deoxyuridine (IdU)	Sigma-Aldrich	I7125
5-Chloro-2′-deoxy-uridine (CldU)	Sigma	C6891
Microscope slides SuperFrost	VWR	631-0910
Cover slips No1	Scientific lab suppplies	MIC3234
Vectashield mounting medium	H-1000 Vector lab	H-1000
Anti-BrdU antibody (mouse)	BD Biosciences	347580
Anti-BrdU antibody (rat)	Abcam	ab6326
sheep anti-mouse Cy3	Sigma	C2181
goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody	Invitrogen	A110060