二层共培养小学的大鼠皮层神经元和神经胶质
Summary
在这里，我们培养大鼠皮层神经元胶质滋养层的存在提供了一个协议。培养的神经元建立极性和创建的突触，可以用于各种应用，如电生理，钙成像，细胞存活率检测，免疫细胞化学，和RNA / DNA /蛋白分离，神经胶质细胞的分离。
Abstract
此影片将引导您通过培养大鼠皮层神经元胶质滋养层，称为一个二层或联合培养模式系统的存在的过程。该系统适用于各种需要的玻璃或塑料增长基板的实验需要，也可以用于其他类型的神经元的文化。
从后期的胚胎阶段（E17）中获得的大鼠皮层神经元均镀上盖玻片或组织培养皿中的神经胶质细胞饲养层菜肴或塑料盖玻片 （作为Thermanox），分别增长面临。具体的实验使用的技术，这可能需要，或不取决于两种配置的选择，即神经元生长在玻璃上（如钙成像与免疫印迹）。胶质细胞饲养层，混合胶质细胞星形胶质细胞，丰富了中学文化，分别是准备前的神经元新生幼鼠皮层（P2 – 4）清扫。
这个文化系统的一个主要优势相比，神经元的文化不仅是神经细胞生长，生存，从胶质滋养层，更准确地类似于大脑体内环境分泌的营养因子提供差异化的支持。此外，共培养可用于研究神经胶质细胞相互作用1。
与此同时，神经胶质细胞在神经元层的污染，是防止不同的手段，几乎是纯的神经元层（低密度文化，除了有丝分裂抑制剂，缺乏血清和使用优化培养基），可比其他方法1 -3。胶质层神经元可以很容易地分离过程中随时文化和不同实验应用范围从5，生物化学，细胞和分子生物学5-8电4，成像和麦克风使用roscopy 4,6,7,9,10。主要的神经元的延长轴突和树突，形成功能性突触的11，这是不是在神经细胞株的观察过程中，虽然一些细胞系扩展过程。
使用这种合作培养体系，培养大鼠海马神经元的一个详细的协议已被描述以前 4,12,13 。在这里，我们详细的修改协议，适合皮层神经元。从每只大鼠胚胎回收约20 × 10 6细胞，这种方法特别适用于需要大量的神经元（但不是一个高度同质的神经元群）的实验是有用的。编制的神经元和神经胶质细胞需要在一个具体时间的方式的计划。我们将提供一步一步培养大鼠皮层神经元的协议，以及培养的神经胶质细胞支持神经元。
Protocol
Discussion
该协议提供了一个方法培养大鼠原代皮质神经元的神经胶质细胞的存在，同时使神经元容易被孤立的实验分析。一个健康的神经细胞表型的神经胶质细胞支持发展，同时也调节神经元的反应，在生理相关的方式的试验性治疗。此外，传代之前，培养这种细胞群成为在星形胶质细胞的选择性丰富与神经元的主要神经胶质细胞，从而阻止炎症的小胶质细胞的刺激。然而，对于某些类型的实验，可能所?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢以前的实验室成员谁促成了这个协议的细化和国立卫生研究院（DA19808，DA15014到OM）多年来的支持。安娜阿布特1“在neuroAIDS跨学科和转化研究训练”（T32 – MH078795）研究员;因此，这项工作是支持部分露丝属Kirschstein国家研究服务奖5T32MH079785下由美国国立卫生研究院。
Materials
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Glucose | 16 mM |
| Sucrose | 22 mM |
| NaCl | 135 mM |
| KCl | 5 mM |
| Na2HPO4 | 1 mM |
| KH2PO4 | 0.22 mM |
| HEPES | 10 mM |
| pH | 7.4 |
| Osmolarity | 310±10 mOsm |
Table 1. Dissection Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| FBS | 10% |
| Gentamicin | 50 μg/mL |
Tabe 2. Glia Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| Horse Serum | 10% |
Table 3. Neuron Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 98% |
| N2 Supplement | 1% |
| 1M HEPES | 1% |
| Ovalbumin | 50 mg/100mL |
Table 4. N2 Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Boric Acid | 50 mM |
| Sodium Borate | 12.5 mM |
Table 5. Borate Buffer (for poly-lysine).
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) |
Invitrogen | 11995-073 |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat-inactivated | Hyclone | 26400-044 |
| Horse Serum, Heat-inactivated | Hyclone | H1138 |
| Gentamicin (50mg/mL) | Invitrogen | 15750-060 |
| N2 Supplement (100x) | Invitrogen | 17502-048 |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 |
| Albumin from chicken egg white, Grade VI (Ovalbumin) |
Sigma-Aldrich | A2512 |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen | 15090-046 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) |
Sigma-Aldrich | D-5025 |
| Paraplast | Fisher | 12-646-106 |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma-Aldrich | C6645 |
| Stereomicroscope | Leica | Leica ZOOM 2000 |
| Cover glasses, Circles, 15 mm, Thickness 0.13-0.17 mm |
Carolina | 633031 |
| Thermanox sheets | Grace BioLabs | HS4550 |
| Large forceps | Biomedical 연구 Instruments |
70-4000 |
| Fine-tipped No.5 forceps | Fine Science Tools |
91150-20 |
| Pattern No.1 forceps | Biomedical 연구 |
10-1400 |
| Instruments | ||
| Scissors, straight, sharp-blunt | Biomedical 연구 Instruments |
28-1435 |
| Micro Dissecting scissors | Biomedical 연구 Instruments |
11-2070 |
| Micro Dissecting Curved scissors | Biomedical 연구 Instruments |
11-1395 |
References
- Cook, A. Interactions between chemokines: regulation of fractalkine/CX3CL1 homeostasis by SDF/CXCL12 in cortical neurons. J. Biol. Chem. 285, 10563-10563 (2010).
- Nicolai, J., Burbassi, S., Rubin, J., Meucci, O. CXCL12 inhibits expression of the NMDA receptor’s NR2B subunit through a histone deacetylase-dependent pathway contributing to neuronal survival. Cell. Death. Dis. 1, e33-e33 (2010).
- Sengupta, R. Morphine increases brain levels of ferritin heavy chain leading to inhibition of CXCR4-mediated survival signaling in neurons. J. Neurosci. 29, 2534-2544 (2009).
- Meucci, O. Chemokines regulate hippocampal neuronal signaling and gp120 neurotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 14500-14500 (1998).
- Khan, M. Z. Regulation of neuronal P53 activity by CXCR 4. Mol. Cell. Neurosci. 30, 58-66 (2005).
- Patel, J. P. Modulation of neuronal CXCR4 by the micro-opioid agonist DAMGO. J. Neurovirol. 12, 492-500 (2006).
- Shimizu, S. Role of the transcription factor E2F1 in CXCR4-mediated neurotoxicity and HIV neuropathology. Neurobiol. Dis. 25, 17-26 (2007).
- Khan, M. Z. The chemokine receptor CXCR4 regulates cell-cycle proteins in neurons. J. Neurovirol. 9, 300-314 (2003).
- Khan, M. Z. The chemokine CXCL12 promotes survival of postmitotic neurons by regulating Rb protein. Cell. Death. Differ. 15, 1663-1672 (2008).
- Khan, M. Z., Vaidya, A., Meucci, O. CXCL12-mediated regulation of ANP32A/Lanp, a component of the inhibitor of histone acetyl transferase (INHAT) complex, in cortical neurons. J. Neuroimmune. Pharmacol. 6, 163-170 (2011).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8, 1454-1468 (1988).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Goslin, K., Banker, G., Goslin, K., Banker, G. . Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
- D’Ambrosio, J., Fatatis, A. Osteoblasts modulate Ca2+ signaling in bone-metastatic prostate and breast cancer cells. Clin. Exp. Metastasis. 26, 955-964 (2009).
