Bilaminar Co-kultur Primary Rat Kortikal neuroner og glia
Summary
Her giver vi en protokol til dyrkning rotte cortical neuroner i overværelse af en glial feeder lag. De dyrkede neuroner etablere polaritet og skabe synapser, og kan adskilles fra den glia til brug i forskellige applikationer, såsom elektrofysiologi, calcium imaging, celle overlevelse assays, immuncytokemi, og RNA / DNA / protein isolation.
Abstract
Denne video vil guide dig gennem processen med dyrkning rotte kortikale neuroner i overværelse af en glial feeder lag, et system kendt som en bilaminar eller co-kultur model. Dette system er velegnet til en lang række eksperimentelle behov, der kræver enten et glas eller plastik vækst substrat og kan også bruges til dyrkning af andre typer af neuroner.
Rotte kortikale neuroner fra slutningen af fosterstadiet (E17) er belagt på glas dækglas eller vævskultur retter står over for en feeder lag af glia dyrket på fade eller plast dækglas (kendt som Thermanox), hhv. Valget mellem de to konfigurationer afhænger af den specifikke eksperimentelle anvendte teknik, som kan kræve, eller ej, er, at neuroner dyrket på glas (fx calcium imaging versus Western blot). Den glial feeder lag, en astroglia-beriget sekundære kultur blandet glia, er adskilt tilberedt fra cortex af nyfødte rotteunger (P2-4) forud for den neuronaledissektion.
En stor fordel ved denne kultur systemet i forhold til en kultur af neuroner kun støtte fra neuronale vækst, overlevelse og differentiering leveret af trofiske faktorer, der udskilles fra glial feeder lag, som mere præcist ligner hjernen miljø in vivo. Endvidere kan den fælles kultur, der bruges til at studere neuronal-glial interaktioner 1.
Samtidig er glia forurening i den neuronale lag forebygges med forskellige midler (low density kultur, tilsætning af mitotiske hæmmere, mangel på serum og brug af optimerede kultur middel), der fører til en næsten ren neuronale lag, der kan sammenlignes med andre etablerede metode 1 -3. Neuroner let kan adskilles fra glial lag på ethvert tidspunkt under kultur og anvendes til forskellige eksperimentelle applikationer lige fra elektrofysiologi 4, cellulær og molekylær biologi 5-8, biokemi 5, billedbehandling og microscopy 4,6,7,9,10. Den primære neuroner udvide axoner og dendritter til at danne funktionelle synapser 11, en proces, der ikke er observeret i neuronale cellelinjer, selv om nogle cellelinier gøre forlænge processer.
En detaljeret protokol med dyrkning rotte hippocampus neuroner ved hjælp af denne co-kultur-system er blevet beskrevet tidligere 4,12,13. Her har vi detalje en modificeret protokol velegnet til kortikale neuroner. Da ca 20×10 6 celler inddrives fra hver rotte foster, denne metode er især nyttig for eksperimenter, der kræver et stort antal neuroner (men ikke bekymret over en meget homogen neuronal befolkning). Udarbejdelsen af neuroner og glia skal planlægges i en tid-specifik måde. Vi vil give trin-for-trin-protokol til dyrkning rotte cortex neuroner samt dyrkning af gliaceller at støtte neuroner.
Protocol
Discussion
Denne protokol giver en metode til dyrkning rotte primære kortikale neuroner i overværelse af glia celler, samtidig med at de neuroner til at være let isoleret i eksperimentel analyse. Den glia støtte udviklingen af en sund neuronal fænotype, samtidig med modulerende neuronale reaktioner på eksperimentelle behandlinger i en fysiologisk relevant måde. Derudover ved passaging den primære glia før kultivering med neuroner denne celle population bliver selektivt beriget med astrocytes, hvilket forhindrer infl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker tidligere laboratorium medlemmer, der har bidraget til videreudvikling af denne protokol og NIH for støtte i årene (DA19808 og DA15014 til OM). Anna Abt 1 er en fyr af "Tværfaglig og Translationel forskeruddannelse i neuroAIDS" (T32-MH078795), og således blev dette arbejde støttet delvist af National Institutes of Health i henhold til Ruth L. Kirschstein National Research Service Award 5T32MH079785.
Materials
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Glucose | 16 mM |
| Sucrose | 22 mM |
| NaCl | 135 mM |
| KCl | 5 mM |
| Na2HPO4 | 1 mM |
| KH2PO4 | 0.22 mM |
| HEPES | 10 mM |
| pH | 7.4 |
| Osmolarity | 310±10 mOsm |
Table 1. Dissection Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| FBS | 10% |
| Gentamicin | 50 μg/mL |
Tabe 2. Glia Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| Horse Serum | 10% |
Table 3. Neuron Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 98% |
| N2 Supplement | 1% |
| 1M HEPES | 1% |
| Ovalbumin | 50 mg/100mL |
Table 4. N2 Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Boric Acid | 50 mM |
| Sodium Borate | 12.5 mM |
Table 5. Borate Buffer (for poly-lysine).
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) |
Invitrogen | 11995-073 |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat-inactivated | Hyclone | 26400-044 |
| Horse Serum, Heat-inactivated | Hyclone | H1138 |
| Gentamicin (50mg/mL) | Invitrogen | 15750-060 |
| N2 Supplement (100x) | Invitrogen | 17502-048 |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 |
| Albumin from chicken egg white, Grade VI (Ovalbumin) |
Sigma-Aldrich | A2512 |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen | 15090-046 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) |
Sigma-Aldrich | D-5025 |
| Paraplast | Fisher | 12-646-106 |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma-Aldrich | C6645 |
| Stereomicroscope | Leica | Leica ZOOM 2000 |
| Cover glasses, Circles, 15 mm, Thickness 0.13-0.17 mm |
Carolina | 633031 |
| Thermanox sheets | Grace BioLabs | HS4550 |
| Large forceps | Biomedical 연구 Instruments |
70-4000 |
| Fine-tipped No.5 forceps | Fine Science Tools |
91150-20 |
| Pattern No.1 forceps | Biomedical 연구 |
10-1400 |
| Instruments | ||
| Scissors, straight, sharp-blunt | Biomedical 연구 Instruments |
28-1435 |
| Micro Dissecting scissors | Biomedical 연구 Instruments |
11-2070 |
| Micro Dissecting Curved scissors | Biomedical 연구 Instruments |
11-1395 |
References
- Cook, A. Interactions between chemokines: regulation of fractalkine/CX3CL1 homeostasis by SDF/CXCL12 in cortical neurons. J. Biol. Chem. 285, 10563-10563 (2010).
- Nicolai, J., Burbassi, S., Rubin, J., Meucci, O. CXCL12 inhibits expression of the NMDA receptor’s NR2B subunit through a histone deacetylase-dependent pathway contributing to neuronal survival. Cell. Death. Dis. 1, e33-e33 (2010).
- Sengupta, R. Morphine increases brain levels of ferritin heavy chain leading to inhibition of CXCR4-mediated survival signaling in neurons. J. Neurosci. 29, 2534-2544 (2009).
- Meucci, O. Chemokines regulate hippocampal neuronal signaling and gp120 neurotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 14500-14500 (1998).
- Khan, M. Z. Regulation of neuronal P53 activity by CXCR 4. Mol. Cell. Neurosci. 30, 58-66 (2005).
- Patel, J. P. Modulation of neuronal CXCR4 by the micro-opioid agonist DAMGO. J. Neurovirol. 12, 492-500 (2006).
- Shimizu, S. Role of the transcription factor E2F1 in CXCR4-mediated neurotoxicity and HIV neuropathology. Neurobiol. Dis. 25, 17-26 (2007).
- Khan, M. Z. The chemokine receptor CXCR4 regulates cell-cycle proteins in neurons. J. Neurovirol. 9, 300-314 (2003).
- Khan, M. Z. The chemokine CXCL12 promotes survival of postmitotic neurons by regulating Rb protein. Cell. Death. Differ. 15, 1663-1672 (2008).
- Khan, M. Z., Vaidya, A., Meucci, O. CXCL12-mediated regulation of ANP32A/Lanp, a component of the inhibitor of histone acetyl transferase (INHAT) complex, in cortical neurons. J. Neuroimmune. Pharmacol. 6, 163-170 (2011).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8, 1454-1468 (1988).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Goslin, K., Banker, G., Goslin, K., Banker, G. . Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
- D’Ambrosio, J., Fatatis, A. Osteoblasts modulate Ca2+ signaling in bone-metastatic prostate and breast cancer cells. Clin. Exp. Metastasis. 26, 955-964 (2009).
