Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia
Summary
Hier bieten wir Ihnen ein Protokoll für die Kultivierung von Ratten kortikalen Neuronen in der Gegenwart eines Glia-Feeder-Schicht. Die kultivierten Neuronen zu etablieren Polarität und erstellen Synapsen, und kann von der Glia für den Einsatz in verschiedenen Anwendungen, wie zB Elektrophysiologie, Kalzium-Imaging, das Überleben der Zelle Assays, Immunzytochemie und RNA / DNA / Protein-Isolierung getrennt werden.
Abstract
Dieses Video wird Sie durch den Prozess der Kultivierung Ratte kortikalen Neuronen in der Gegenwart eines Glia-Feeder-Schicht, ein System als zweischichtige oder Co-Kultur-Modell bekannt zu führen. Dieses System eignet sich für eine Vielzahl von experimentellen Anforderungen erfordern entweder ein Glas oder Kunststoff Aufwachssubstrats und kann auch für die Kultur des anderen Typen von Neuronen verwendet werden.
Rat kortikalen Neuronen aus dem späten Embryonalstadium (E17) gewonnen werden, auf Deckgläser oder Gewebekulturschalen vor einer Feeder-Schicht von Gliazellen auf dem Geschirr oder Kunststoff Deckgläser (bekannt als Thermanox) gewachsen, bzw. vergoldet. Die Wahl zwischen den beiden Konfigurationen hängt von den spezifischen experimentellen Technik verwendet, die gegebenenfalls verlangen, oder nicht, sind die Neuronen auf Glas (z. B. Calcium-Imaging im Vergleich zu Western-Blot) gewachsen. Die Glia-Feeder-Schicht, eine Astroglia angereicherte sekundäre Kultur des gemischten Glia, getrennt von den Rinden der neugeborenen Ratte Welpen (P2-4), die vor der neuronalenDissektion.
Ein großer Vorteil dieser Kultur-System als eine Kultur der Neuronen im Vergleich nur die Unterstützung der neuronalen Wachstum, Überleben und die Differenzierung von trophischen Faktoren aus der Glia-Feeder-Schicht, die genauer ähnelt das Gehirn Umwelt in vivo sezerniert zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus kann die Co-Kultur verwendet werden, um neuronal-glialen Interaktionen 1-Studie sein.
Zur gleichen Zeit ist Glia Kontamination in der neuronalen Ebene mit unterschiedlichen Mitteln (low density Kultur, Zugabe von Mitosehemmer, Mangel an Serum und die Verwendung von optimierten Kulturmedium) führen zu einem nahezu reinen neuronalen Ebene, vergleichbar mit anderen etablierten Methoden 1 verhindert -3. Neuronen können leicht von den Gliazellen Schicht jederzeit getrennt während der Kultur und für verschiedene experimentelle Anwendungen von Elektrophysiologie 4, Zell-und Molekularbiologie 5-8, Biochemie 5, Bildgebung und microscopy 4,6,7,9,10. Der primäre Neuronen verlängern Axone und Dendriten bilden funktionelle Synapsen 11, ein Vorgang, der nicht in neuronalen Zelllinien beobachtet wird, obwohl einige Zelllinien Prozesse erstrecken.
Ein detailliertes Protokoll der Kultivierung Ratte Hippocampus-Neuronen mit dieser Co-Kultur-System wurde zuvor 4,12,13 beschrieben. Hier haben wir ausführlich ein modifiziertes Protokoll für kortikale Neuronen geeignet. Wie etwa 20×10 6 Zellen voneinander Rattenembryo zurückgewonnen werden, ist diese Methode besonders nützlich für Experimente erfordern eine große Anzahl von Neuronen (nicht aber über ein sehr homogenes neuronalen betroffene Bevölkerung). Die Aufstellung von Neuronen und Gliazellen muss in einer Zeit-spezifischen Art und Weise geplant werden. Wir werden die Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Kultivierung Ratte kortikalen Neuronen sowie Kultivierung Gliazellen um die Neuronen zu unterstützen.
Protocol
Discussion
Dieses Protokoll sieht ein Verfahren zur Kultivierung Ratte primären kortikalen Neuronen in Gegenwart von Gliazellen, während gleichzeitig die Neuronen auf einfache Weise für die experimentelle Analyse isoliert werden. Die Glia-Unterstützung Entwicklung eines gesunden neuronalen Phänotyp, während auch modulierende neuronale Reaktionen auf experimentelle Behandlungen in einem physiologisch relevanten Art und Weise. Zusätzlich kann durch die Passage der primären Gliazellen vor Kultivierung mit Neuronen dieser Zell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken früheren Labor Mitglieder, die Verfeinerung des Protokolls und der NIH für die Unterstützung im Laufe der Jahre (DA19808 und DA15014 zu OM) beigetragen. Anna Abt 1 ist ein Fellow des "Interdisciplinary und Translational Research Training in NeuroAIDS" (T32-MH078795); damit dieser Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health unter Ruth L. Kirschstein National Research Service Award 5T32MH079785 unterstützt.
Materials
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Glucose | 16 mM |
| Sucrose | 22 mM |
| NaCl | 135 mM |
| KCl | 5 mM |
| Na2HPO4 | 1 mM |
| KH2PO4 | 0.22 mM |
| HEPES | 10 mM |
| pH | 7.4 |
| Osmolarity | 310±10 mOsm |
Table 1. Dissection Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| FBS | 10% |
| Gentamicin | 50 μg/mL |
Tabe 2. Glia Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| Horse Serum | 10% |
Table 3. Neuron Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 98% |
| N2 Supplement | 1% |
| 1M HEPES | 1% |
| Ovalbumin | 50 mg/100mL |
Table 4. N2 Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Boric Acid | 50 mM |
| Sodium Borate | 12.5 mM |
Table 5. Borate Buffer (for poly-lysine).
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) |
Invitrogen | 11995-073 |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat-inactivated | Hyclone | 26400-044 |
| Horse Serum, Heat-inactivated | Hyclone | H1138 |
| Gentamicin (50mg/mL) | Invitrogen | 15750-060 |
| N2 Supplement (100x) | Invitrogen | 17502-048 |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 |
| Albumin from chicken egg white, Grade VI (Ovalbumin) |
Sigma-Aldrich | A2512 |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen | 15090-046 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) |
Sigma-Aldrich | D-5025 |
| Paraplast | Fisher | 12-646-106 |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma-Aldrich | C6645 |
| Stereomicroscope | Leica | Leica ZOOM 2000 |
| Cover glasses, Circles, 15 mm, Thickness 0.13-0.17 mm |
Carolina | 633031 |
| Thermanox sheets | Grace BioLabs | HS4550 |
| Large forceps | Biomedical 연구 Instruments |
70-4000 |
| Fine-tipped No.5 forceps | Fine Science Tools |
91150-20 |
| Pattern No.1 forceps | Biomedical 연구 |
10-1400 |
| Instruments | ||
| Scissors, straight, sharp-blunt | Biomedical 연구 Instruments |
28-1435 |
| Micro Dissecting scissors | Biomedical 연구 Instruments |
11-2070 |
| Micro Dissecting Curved scissors | Biomedical 연구 Instruments |
11-1395 |
References
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