Bilaminar משותף התרבות של נוירונים בקליפת המוח עכברוש ראשי גליה
Summary
כאן אנו מספקים פרוטוקול עכברוש נוירונים בקליפת המוח culturing בנוכחות שכבה מזין גליה. נוירונים בתרבית להקים הקוטביות וליצור סינפסות, והוא יכול להיות מופרד גליה לשימוש ביישומים שונים, כגון electrophysiology, הדמיה סידן, מבחני הישרדות התא, immunocytochemistry, ו-RNA / DNA / בידוד החלבון.
Abstract
סרט הווידאו הזה ינחה אותך בתהליך של עכברוש נוירונים בקליפת המוח culturing בנוכחות שכבה מזין גליה, מערכת המכונה bilaminar או שיתוף תרבות מודל. מערכת זו מתאימה למגוון צרכים הדורשים ניסיוני או כוס או מצע גידול פלסטיק יכול לשמש גם עבור התרבות של סוגים אחרים של נוירונים.
נוירונים בקליפת המוח עכברוש המתקבל בשלב עוברי מאוחר (E17) הם על coverslips מצופה זכוכית או בתרבית רקמה מנות מול שכבת מזין של גליה גדל על כלים או coverslips פלסטיק (המכונה Thermanox), בהתאמה. הבחירה בין שתי תצורות תלוי בטכניקה ניסויית מסוימת בשימוש, אשר עשויים לדרוש, או לא, נוירונים, כי הם גדלו על זכוכית (למשל, הדמיה סידן לעומת המערב כתם). השכבה מזין גליה, תרבות astroglia מועשר המשני של גליה מעורבת, מוכן בנפרד הקורטקס של גורי חולדה היילוד (P2-4) לפני העצביתדיסקציה.
היתרון העיקרי של מערכת זו תרבות לעומת תרבות של נוירונים היחיד הוא תמיכה של צמיחה הישרדות העצבית, והבחנה המסופקים על ידי גורמים trophic המופרשים מהשכבה מזין גליה, אשר דומה בצורה מדויקת יותר את הסביבה המוח in vivo. יתר על כן, שיתוף התרבות יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות עצביות, גליה 1.
במקביל, זיהום גליה בשכבת העצבית נמנעת באמצעים שונים (תרבות צפיפות נמוכה, תוספת של מעכבי mitotic, חוסר להשתמש בסרום של המדיום תרבות אופטימיזציה) המובילה בשכבה עצבי טהור כמעט, בהשוואה לשיטות אחרות שהוקמו 1 -3. נוירונים ניתן להפריד בקלות בכל עת מהשכבה גליה במהלך התרבות משמשת ליישומים ניסויים שונים הנעים בין 4 electrophysiology, ביולוגיה תאית ומולקולרית 5-8, 5 ביוכימיה, הדמיה מיקרופוןroscopy 4,6,7,9,10. הנוירונים העיקרי להאריך אקסונים דנדריטים וסינפסות כדי ליצור תפקודית 11, תהליך אשר אינו שנצפתה שורות תאים עצביים, למרות כמה שורות תאים לעשות להאריך תהליכים.
פרוטוקול מפורט של עכברוש נוירונים בהיפוקמפוס culturing באמצעות מערכת שיתוף תרבות תוארה בעבר 4,12,13. כאן אנו פרט פרוטוקול שונה מתאים נוירונים בקליפת המוח. כמו כ 20×10 6 תאים התאושש העובר כל עכברוש, שיטה זו שימושית במיוחד עבור ניסויים הדורשים כמויות גדולות של נוירונים (אך לא מודאג אוכלוסייה הומוגנית מאוד נוירונים). הכנת נוירונים גליה צריך להיות מתוכנן באופן ספציפי זמן. אנו נספק את פרוטוקול צעד אחר צעד עכברוש נוירונים בקליפת המוח culturing כמו גם בתאי גלייה culturing לתמוך נוירונים.
Protocol
Discussion
פרוטוקול זה מספק שיטה עכברוש נוירונים בקליפת המוח culturing העיקרי בנוכחות תאים גליה, תוך מתן אפשרות לתאי העצב להיות מבודד בקלות לניתוח ניסיוני. תמיכה גליה התפתחות פנוטיפ בריא העצבית, בעוד תגובות עצביות ויסות גם טיפולים ניסיוניים באופן רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. בנוסף, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לחברי מעבדה קודמות שתרמו עידון של פרוטוקול זה, ה-NIH על התמיכה לאורך השנים (DA19808 ו DA15014 ל OM). אנה אבט 1 הוא עמית של "אימון המחקר הבינתחומי Translational ב neuroAIDS" (T32-MH078795), ולכן עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים תחת רות ל 'פרס Kirschstein הלאומית למחקר שירות 5T32MH079785.
Materials
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Glucose | 16 mM |
| Sucrose | 22 mM |
| NaCl | 135 mM |
| KCl | 5 mM |
| Na2HPO4 | 1 mM |
| KH2PO4 | 0.22 mM |
| HEPES | 10 mM |
| pH | 7.4 |
| Osmolarity | 310±10 mOsm |
Table 1. Dissection Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| FBS | 10% |
| Gentamicin | 50 μg/mL |
Tabe 2. Glia Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| Horse Serum | 10% |
Table 3. Neuron Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 98% |
| N2 Supplement | 1% |
| 1M HEPES | 1% |
| Ovalbumin | 50 mg/100mL |
Table 4. N2 Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Boric Acid | 50 mM |
| Sodium Borate | 12.5 mM |
Table 5. Borate Buffer (for poly-lysine).
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) |
Invitrogen | 11995-073 |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat-inactivated | Hyclone | 26400-044 |
| Horse Serum, Heat-inactivated | Hyclone | H1138 |
| Gentamicin (50mg/mL) | Invitrogen | 15750-060 |
| N2 Supplement (100x) | Invitrogen | 17502-048 |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 |
| Albumin from chicken egg white, Grade VI (Ovalbumin) |
Sigma-Aldrich | A2512 |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen | 15090-046 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) |
Sigma-Aldrich | D-5025 |
| Paraplast | Fisher | 12-646-106 |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma-Aldrich | C6645 |
| Stereomicroscope | Leica | Leica ZOOM 2000 |
| Cover glasses, Circles, 15 mm, Thickness 0.13-0.17 mm |
Carolina | 633031 |
| Thermanox sheets | Grace BioLabs | HS4550 |
| Large forceps | Biomedical 연구 Instruments |
70-4000 |
| Fine-tipped No.5 forceps | Fine Science Tools |
91150-20 |
| Pattern No.1 forceps | Biomedical 연구 |
10-1400 |
| Instruments | ||
| Scissors, straight, sharp-blunt | Biomedical 연구 Instruments |
28-1435 |
| Micro Dissecting scissors | Biomedical 연구 Instruments |
11-2070 |
| Micro Dissecting Curved scissors | Biomedical 연구 Instruments |
11-1395 |
References
- Cook, A. Interactions between chemokines: regulation of fractalkine/CX3CL1 homeostasis by SDF/CXCL12 in cortical neurons. J. Biol. Chem. 285, 10563-10563 (2010).
- Nicolai, J., Burbassi, S., Rubin, J., Meucci, O. CXCL12 inhibits expression of the NMDA receptor’s NR2B subunit through a histone deacetylase-dependent pathway contributing to neuronal survival. Cell. Death. Dis. 1, e33-e33 (2010).
- Sengupta, R. Morphine increases brain levels of ferritin heavy chain leading to inhibition of CXCR4-mediated survival signaling in neurons. J. Neurosci. 29, 2534-2544 (2009).
- Meucci, O. Chemokines regulate hippocampal neuronal signaling and gp120 neurotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 14500-14500 (1998).
- Khan, M. Z. Regulation of neuronal P53 activity by CXCR 4. Mol. Cell. Neurosci. 30, 58-66 (2005).
- Patel, J. P. Modulation of neuronal CXCR4 by the micro-opioid agonist DAMGO. J. Neurovirol. 12, 492-500 (2006).
- Shimizu, S. Role of the transcription factor E2F1 in CXCR4-mediated neurotoxicity and HIV neuropathology. Neurobiol. Dis. 25, 17-26 (2007).
- Khan, M. Z. The chemokine receptor CXCR4 regulates cell-cycle proteins in neurons. J. Neurovirol. 9, 300-314 (2003).
- Khan, M. Z. The chemokine CXCL12 promotes survival of postmitotic neurons by regulating Rb protein. Cell. Death. Differ. 15, 1663-1672 (2008).
- Khan, M. Z., Vaidya, A., Meucci, O. CXCL12-mediated regulation of ANP32A/Lanp, a component of the inhibitor of histone acetyl transferase (INHAT) complex, in cortical neurons. J. Neuroimmune. Pharmacol. 6, 163-170 (2011).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8, 1454-1468 (1988).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Goslin, K., Banker, G., Goslin, K., Banker, G. . Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
- D’Ambrosio, J., Fatatis, A. Osteoblasts modulate Ca2+ signaling in bone-metastatic prostate and breast cancer cells. Clin. Exp. Metastasis. 26, 955-964 (2009).
