Didermique co-culture de neurones de rat corticale primaire et des cellules gliales
Summary
Ici nous fournissons un protocole de neurones de rat en culture corticaux, en présence d'une couche nourricière gliales. Les neurones cultivés en place de polarité et de créer des synapses, et peut être séparée de la glie pour une utilisation dans diverses applications, telles que l'électrophysiologie, imagerie calcique, tests de survie cellulaire, immunocytochimie, et de l'ARN / ADN / isolement des protéines.
Abstract
Cette vidéo va vous guider dans le processus de neurones de rat en culture corticaux, en présence d'une couche nourricière gliales, un système connu comme un bilaminaire ou co-culture de modèle. Ce système est approprié pour une variété de besoins expérimentaux nécessitant soit un verre ou de plastique et substrat de croissance peut également être utilisé pour la culture des autres types de neurones.
Neurones corticaux de rat obtenu à partir de la phase tardive embryonnaires (E17) sont étalées sur des lamelles de verre ou de boîtes de culture tissulaire face à une couche nourricière de cellules gliales cultivées sur des lamelles en plastique ou des plats (connu sous le nom Thermanox), respectivement. Le choix entre les deux configurations dépend de la technique expérimentale utilisée spécifiques, qui peuvent exiger, ou non, que les neurones sont cultivés sur le verre (par exemple l'imagerie calcique par rapport Western blot). La couche nourricière gliales, les astrocytes une culture enrichie de cellules gliales secondaires mixtes, est préparé séparément à partir du cortex des ratons nouveau-nés (P2-4) avant le neuronaledissection.
Un avantage majeur de ce système de culture par rapport à une culture de neurones est seulement le soutien de la croissance neuronale, la survie et la différenciation fournies par des facteurs trophiques sécrétés de la couche nourricière gliales, qui ressemble plus précisément l'environnement du cerveau in vivo. Par ailleurs, la co-culture peut être utilisée pour étudier les interactions neuronales-gliales 1.
Dans le même temps, la contamination glie dans la couche de neurones est empêchée par des moyens différents (culture à faible densité, l'ajout d'inhibiteurs mitotiques, le manque de sérum et de l'utilisation de milieu de culture optimisé) conduisant à une couche pratiquement pure neuronale, comparable à d'autres méthodes établies 1 -3. Les neurones peuvent être facilement séparées de la couche gliales à tout moment pendant la culture et utilisés pour différentes applications allant de l'électrophysiologie expérimentale 4, biologie cellulaire et moléculaire 5-8, 5 biochimie, l'imagerie et le microroscopy 4,6,7,9,10. Les neurones primaires s'étendent axones et dendrites de former des synapses fonctionnelles 11, un processus qui n'est pas observée dans les lignées cellulaires neuronales, même si certaines lignées cellulaires ne s'étendent processus.
Un protocole détaillé de neurones de rat en culture hippocampe en utilisant ce système de co-culture a été décrit précédemment 4,12,13. Ici, nous détaillons un protocole modifié adapté pour les neurones corticaux. Comme environ 20×10 6 cellules sont récupérées à partir de chaque embryon de rat, cette méthode est particulièrement utile pour des expériences nécessitant un grand nombre de neurones (mais pas préoccupé par une population très homogène neuronale). La préparation des neurones et cellules gliales doit être planifiée dans des délais spécifiques. Nous allons fournir le protocole étape par étape pour la culture de neurones de rat corticale ainsi que la culture de cellules gliales pour soutenir les neurones.
Protocol
Discussion
Ce protocole prévoit un procédé de culture primaires de rat neurones corticaux, en présence de cellules gliales, tout en permettant aux neurones pour être facilement isolé pour analyse expérimentale. L'appui au développement d'un phénotype glie santé neuronale, tout en modulant les réponses neuronales à des traitements expérimentaux de manière physiologiquement pertinents. De plus, par passage de la glie primaire avant la culture avec les neurones de cette population cellulaire devient sélective e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient les membres de laboratoire antérieurs qui ont contribué au raffinement de ce protocole et le NIH pour le soutien au fil des ans (et DA19808 DA15014 à l'OM). Anna Abt 1 est un membre de la "formation à la recherche interdisciplinaire et translationnelle NeuroSIDA" (T32-MH078795); donc, ce travail a été soutenu en partie par les Instituts nationaux de santé en vertu de Ruth L. Kirschstein National Research Service Award 5T32MH079785.
Materials
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Glucose | 16 mM |
| Sucrose | 22 mM |
| NaCl | 135 mM |
| KCl | 5 mM |
| Na2HPO4 | 1 mM |
| KH2PO4 | 0.22 mM |
| HEPES | 10 mM |
| pH | 7.4 |
| Osmolarity | 310±10 mOsm |
Table 1. Dissection Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| FBS | 10% |
| Gentamicin | 50 μg/mL |
Tabe 2. Glia Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| Horse Serum | 10% |
Table 3. Neuron Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 98% |
| N2 Supplement | 1% |
| 1M HEPES | 1% |
| Ovalbumin | 50 mg/100mL |
Table 4. N2 Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Boric Acid | 50 mM |
| Sodium Borate | 12.5 mM |
Table 5. Borate Buffer (for poly-lysine).
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) |
Invitrogen | 11995-073 |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat-inactivated | Hyclone | 26400-044 |
| Horse Serum, Heat-inactivated | Hyclone | H1138 |
| Gentamicin (50mg/mL) | Invitrogen | 15750-060 |
| N2 Supplement (100x) | Invitrogen | 17502-048 |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 |
| Albumin from chicken egg white, Grade VI (Ovalbumin) |
Sigma-Aldrich | A2512 |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen | 15090-046 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) |
Sigma-Aldrich | D-5025 |
| Paraplast | Fisher | 12-646-106 |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma-Aldrich | C6645 |
| Stereomicroscope | Leica | Leica ZOOM 2000 |
| Cover glasses, Circles, 15 mm, Thickness 0.13-0.17 mm |
Carolina | 633031 |
| Thermanox sheets | Grace BioLabs | HS4550 |
| Large forceps | Biomedical 연구 Instruments |
70-4000 |
| Fine-tipped No.5 forceps | Fine Science Tools |
91150-20 |
| Pattern No.1 forceps | Biomedical 연구 |
10-1400 |
| Instruments | ||
| Scissors, straight, sharp-blunt | Biomedical 연구 Instruments |
28-1435 |
| Micro Dissecting scissors | Biomedical 연구 Instruments |
11-2070 |
| Micro Dissecting Curved scissors | Biomedical 연구 Instruments |
11-1395 |
References
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