Vi har etableret en protokol til induktion af neuroblasts direkte fra pluripotente menneskelige embryonale stamceller opretholdes under definerede betingelser med små molekyler, som giver udledning af et stort udbud af menneskelige neurale stamceller og neuronale celletyper i udviklingslandene CNS for neurale reparation.
Der er et stort udækket behov for et klinisk-egnet menneskelige neuronale celle kilde til reparation eller fornyelse af den beskadigede centrale nervesystem (CNS) struktur og kredsløb i dagens sundhedsvæsen industri. Cellebaserede behandlingsformer ser særdeles lovende ud for at genoprette den tabte nervevæv og funktion for CNS-sygdomme. Imidlertid har celleterapier baseret på CNS-afledte neurale stamceller stødt levere begrænsninger og problemer med at bruge i det kliniske miljø på grund af deres begrænsede ekspansion evne i kultur og svigtende plasticitet efter omfattende passaging 1-3. På trods af nogle gavnlige resultater, synes de CNS-afledte humane neurale stamceller (hNSCs) til at udøve deres terapeutiske virkninger først og fremmest ved deres ikke-neuronale afkom gennem at fremstille trofiske og neuroprotektive molekyler til at redde den endogene cellerne 1-3. Alternativt, pluripotente stamceller fra menneskelige embryoner (hESCs) proffer helbredelsesmetoder for en bred vifte af neurologiske lidelser ved supplying mangfoldigheden af menneskelige neuronale celletyper i udviklingslandene CNS for regenerering 1,4-7. Men hvordan har at kanalisere den brede differentiering potentiale pluripotente hESCs effektivt og forudsigeligt til en ønsket fænotype været en stor udfordring for både udviklings-studier og kliniske oversættelse. Konventionelle metoder stole på multi-slægt hældning af pluripotente celler gennem spontane kimlag differentiering, hvilket resulterer i en ineffektiv og ukontrollabel slægt-engagement, der ofte efterfølges af fænotypiske heterogenitet og ustabilitet dermed en høj risiko for tumorgenicitet 7-10. Herudover kan udefinerede udenlandske / dyre biologiske kosttilskud og / eller foderautomater, der har typisk været anvendt til isolering, ekspansion, og differentiering af hESCs gør direkte brug af en sådan celle-specialiserede grafts hos patienter problematisk 11-13. For at overvinde disse forhindringer har vi løst de elementer af en defineret kultur, der er nødvendige og tilstrækkelige for at sustaining den epiblast pluripotence af hESCs, der tjener som en platform for de novo afledningen af klinisk-egnede hESCs og effektivt lede sådanne hESCs ensartet retning af klinisk relevante slægter af små molekyler 14 (se en skematisk i Fig. 1). Retinsyre (RA) inducerer ikke neuronal differentiering af udifferentierede hESCs vedligeholdes på foderautomater 1, 14. Og i modsætning til mus økonomiske og sociale råd, behandling hESC-opdelte embryoid organer (EBS) kun lidt øger lavt udbytte af neuroner 1, 14, 15. Men efter screening en bred vifte af små molekyler og vækstfaktorer, fandt vi, at disse definerede betingelser gengives retinsyre (RA) er tilstrækkelig til at inducere specifikation af neuroectoderm direkte fra pluripotente hESCs at yderligere udviklet sig til neuroblasts, der har genereret menneskelige neurale stamceller og neuroner i udvikling af CNS med høj effektivitet (fig. 2). Vi definerede betingelser for induktion af neuroblaster direkte fra pluripotente hESCs uden mellemliggende multi-slægt embryoid krop scenen, så velkontrolleret effektiv afledning af et stort udbud af menneskelige neuronale celler i hele spektret af udviklingsstadier for celle-baseret terapi.
En af de store udfordringer for både udviklings-studier og klinisk oversættelsen har været, hvordan at kanalisere den brede differentiering potentiale pluripotente menneskelige stamceller til en ønsket fænotype effektivt og forudsigeligt. Selv om sådanne celler kan differentiere spontant in vitro i celler af alle kim lag ved at gå gennem et multi-afstamning samlede fase, kun en lille brøkdel af celler forfølger en bestemt slægt 1,4. I disse hESC-afledte aggregater, ofte samtidige fremkomst af en betydelig mængde af vidt forskellige uønskede celletyper, der kan opholde sig i tre embryonale kim lag gør fremkomsten af ønskede fænotyper ikke bare ineffektivt, men ukontrollable og upålidelige så godt. Selvom hjerte-og neurale slægter nedstammer i tidligere rapporter, men den manglende effektivitet i at generere specialiserede celler ved hjælp af kim-lag-induktion af pluripotente celler og den store risiko for tumorgenicitet følgende transplantation har forhindret yderligere kliniske oversættelse.
Den hESC linjer oprindeligt blev udledt og vedligeholdes i samarbejde kultur med vækst-anholdt muse embryonale fibroblaster (MEFs) 4. Selv om flere menneskelige feeder, feeder-fri, og kemisk formuleret kultur systemer er blevet udviklet til hESCs 11-13, de elementer nødvendige og tilstrækkelige for at opretholde selv-fornyelse af menneskelige pluripotente celler forbliver uløste. Disse eksogene feeder celler og biologiske reagenser hjælpe med at opretholde den langsigtede stabil vækst af udifferentierede hESCs mens maske evne til pluripotente celler til at reagere på udviklingsmæssige signaler. Fastholdelse af udifferentierede hESCs i en defineret Biologics-fri kultur system, der tillader trofaste ekspansion og kontrollerbar direkte differentiering er en af nøglerne til deres terapeutiske nytteværdi og potentiale. RA var ikke tilstrækkelig til at fremkalde neuronal differentiering af udifferentierede hESCs vedligeholdt under tidligere rapporteret conditionioner indeholder eksogene feeder celler. Selvom neurale lineages vises på et relativt tidligt tidspunkt i hESC differentiering, behandling hESC-opdelte multi-slægt aggregater (embryoid organer) med RA kun lidt øget lavt udbytte af neuroner 1, 14, 15. For at opnå ensartet konvertering af menneskelige pluripotente stamceller til en bestemt slægt, har vi ansat en defineret kultur system, der kan forsikre spredning af udifferentierede hESCs at identificere vilkårene for velkontrolleret effektiv induktion af pluripotente hESCs udelukkende til en bestemt klinisk relevant afstamning ved simpel bestemmelse af små molekyler (Fig. 1, Fig. 2). Fremtidige undersøgelser vil afsløre genetiske og epigenetiske kontrol molekyler i menneskets CNS udvikling som alternativer, der kan bane vejen for småmolekyle-medieret direkte kontrol og modulering af hESC pluripotente skæbne, når der følger klinisk relevant slægter for regenerativ terapi. Uden RA behandling, 1-5% HESCs vil gennemgå en spontan differentiering i neuronerne 1, 14, 15. Med RA behandling, har vi været i stand til at generere> 95% embryonale neuronal progenitorer og neuroner fra hESCs vedligeholdes under en definerer kultur i en proces, der kan efterligne menneskelige embryonale udvikling 14. For nylig har kendt neurale-skæbne afgørende gener blevet brugt til at transdifferentiate muse fibroblaster til voksne neurale stamceller og neuroner med en lav effektivitet på mellem 0,5-8% 17, 18. Imidlertid har omprogrammeret somatiske celler historisk set været forbundet med unormal genekspression og accelereret ældning med nedsat terapeutisk værktøj 19-21. Endelig er den protokol, vi etableret her begrænset til pluripotente hESCs stammer fra den indre cellemasse (ICM) eller epiblast den menneskelige blastocyst 4, kan ikke gælde for andre pluripotente celler, herunder animalsk oprindelse økonomiske og sociale råd, økonomiske og sociale råd stammer fra tidligere morula (otte -celle)-fase embryoner 22, og artificially omprogrammeret celler 23.
The authors have nothing to disclose.
XHP er blevet støttet af National Institute of Health (NIH) tilskud fra National Institute on Aging (NIHK01AG024496) og The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NIHR21HD056530).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
Human laminin | Sigma | L6274 | |
all-trans-Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 10565018 | |
DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
Human transferrin | Sigma | T8158 | |
Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
Human BDNF | PeproTech | AF-450-02 | |
Human VEGF | PeproTech | AF-100-20 | |
Human NT-3 | PeproTech | 450-03 | |
Heparin | Sigma | H5284 | |
N-2 supplement (100X) | Invitrogen | 17502048 | |
6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
6-well plate | Corning | 3516 |