Vi har etableret en protokol til induktion af cardioblasts direkte fra pluripotente menneskelige embryonale stamceller opretholdes under definerede betingelser med små molekyler, som giver udledning af et stort udbud af menneskets hjerte stamceller og funktionelle cardiomyocytter for hjerte-kar-reparation.
Til dato, har manglen på en passende menneskelige hjerte-celle kilde været alvorligt tilbageslag med at regenerere den menneskelige myokardiet, enten ved at cellebaserede transplantation eller hjerte-tissue engineering 1-3. Cardiomyocytter bliver uhelbredeligt-opdelte kort efter fødslen og mister deres evne til at formere sig. Der er ingen beviser for, at stamceller / stamceller fra andre kilder, såsom knoglemarv eller navlestrengsblod, kan give anledning til kontraktile hjertemuskelcellerne efter transplantation ind i hjertet 1-3. Behovet for at regenerere eller reparere beskadigede hjertemusklen er ikke blevet mødt af voksne stamceller terapi, enten endogene eller via celle levering 1-3. Den genetisk stabile humane embryonale stamceller (hESCs) har ubegrænset ekspansion evne og ubegrænset plasticitet, proffering en pluripotente reservoir for in vitro afledning af store forsyninger af humane somatiske celler, der er begrænset til den slægt, der har brugaf reparation og regenerering 4,5. På grund af forekomsten af hjerte-kar-sygdomme på verdensplan og akut mangel på donororganer, der er en intens interesse for at udvikle hESC-baserede terapier som en alternativ fremgangsmåde. Men hvordan har at kanalisere den brede differentiering potentiale pluripotente hESCs effektivt og forudsigeligt til en ønsket fænotype været en stor udfordring for både udviklings-studier og kliniske oversættelse. Konventionelle metoder stole på multi-slægt hældning af pluripotente celler gennem spontane kimlag differentiering, hvilket resulterer i en ineffektiv og ukontrollabel slægt-engagement, der ofte efterfølges af fænotypiske heterogenitet og ustabilitet dermed en høj risiko for tumorgenicitet 6-8 (se skematisk i Fig. 1A). Herudover kan udefinerede udenlandske / dyre biologiske kosttilskud og / eller foderautomater, der har typisk været anvendt til isolering, ekspansion, og differentiering af hESCs gøre direkte brug af disse celle-specialiZed podninger hos patienter problematisk 9-11. For at overvinde disse forhindringer har vi løst de elementer af en defineret kultur, der er nødvendige og tilstrækkelige for at opretholde den epiblast pluripotence af hESCs, der tjener som en platform for de novo afledningen af klinisk-egnede hESCs og effektivt lede sådanne hESCs ensartet retning af klinisk relevant slægter af små molekyler 12 (se en skematisk i Fig. 1B). Efter screening en række af små molekyler og vækstfaktorer, fandt vi, at disse definerede betingelser gengives nikotinamid (NAM) tilstrækkelig til at fremkalde specifikationen af cardiomesoderm direkte fra pluripotente hESCs at yderligere udviklet sig til cardioblasts, der har genereret menneskelige slå cardiomyocytter med høj effektivitet (fig. 2 ). Vi definerede betingelser for induktion af cardioblasts direkte fra pluripotente hESCs uden mellemliggende multi-slægt embryoid krop scenen, så velkontrolleret effektiv afledning af enstore udbud af menneskelige hjerte-celler i hele spektret af udviklingsstadier for celle-baseret terapi.
En af de store udfordringer for både udviklings-studier og klinisk oversættelsen har været, hvordan at kanalisere den brede differentiering potentiale pluripotente menneskelige stamceller til en ønsket fænotype effektivt og forudsigeligt. Selv om sådanne celler kan differentiere spontant in vitro i celler af alle kim lag ved at gå gennem et multi-slægt samlet fase i hESC-afledte multi-slægt aggregater (embryoid organer), kun en meget lille brøkdel af celler (<2%) spontant differentiere sig til cardiomyocytter 13-15 (Fig. 1A). Efter immunoselection, at beriget populationer af cardiomyocytter var i stand til at fungere som biologisk pacemaker at redde funktionen af en beskadiget myokardiet mekanisk og elektronisk efter injektionen ind i hjertet af dyremodeller 13. I gnaver infarcted modeller blev indpodet hESC-afledte hjerte afkom i stand til at overleve og modne op til 12 uger, og delvist remuscularize den skadede hjertet og forbedre den kontraktile funktion 14,15. Imidlertid har den manglende effektivitet i at skabe menneskelige hjerte-engagerede celler gennem multi-slægtslinje differentiering af pluripotente celler og den store risiko for tumorgenicitet efter transplantation hindret yderligere kliniske oversættelse. Udvikling af strategier til at kanalisere den brede differentiering potentiale pluripotente hESCs udelukkende og forudsigeligt til en kardiologisk fænotype er vigtigt at udnytte kraften i hESC biologi i hjertet området. For at opnå ensartet konvertering af menneskelige pluripotente stamceller til en bestemt slægt, har vi ansat en defineret kultur system, der kan forsikre spredning af udifferentierede hESCs at identificere vilkårene for velkontrolleret effektiv induktion af pluripotente hESCs udelukkende til en bestemt klinisk relevant afstamning ved simpel bestemmelse af små molekyler (Fig. 1B). Vi fandt, at nikotinamid kardielle-slægt engagement direkte fra Pluripotent hESCs under definerede kultur, at yderligere udviklet sig til at slå cardiomyocytter med høj effektivitet (fig. 2). Nkx2.5 er en evolutionally bevaret homeobox transkriptionsfaktor uundværlig for normal hjertefunktion udvikling og mutationer af genet er forbundet med menneskelig medfødt hjertesygdom (CHD), den mest almindelige menneskelige fødselsskade 16. Angivelse af Nkx2.5 er den tidligste markør for hjerte precursor celler i alle hvirveldyr hidtil undersøgt og er afgørende for korrekt hjerte septation og dannelse / modning af elektriske ledningssystem 16. I hvirveldyr, omtrent det debut og mønster af tidlig Nkx2.5 udtryk falder sammen med timingen og areal hjerte-specifikation i begyndelsen af embryogenese, og Nkx2.5 gen fortsætter med at komme til udtryk gennem udvikling i hjertet 16. I vores hESC model, syntes NAM at udløse hjertets induktion direkte fra pluripotente hESCs ved at fremme ekspressionen af hjerte-specifikke transcription faktor Nkx2.5 i en proces, der kan emulere specifikation af cardiomesoderm fra pluripotente epiblast i humane embryonale cardiogenesis. Fremtidige undersøgelser vil afsløre genetiske og epigenetiske kontrol molekyler i menneskets hjerte udvikling som alternativer, der kan bane vejen for småmolekyle-medieret direkte kontrol og modulering af hESC pluripotente skæbne, når der følger klinisk relevant slægter for regenerativ terapi. Uden NAM behandling, vil <2% hESCs undergå spontan differentiering i at slå cardiomyocytter 12-15. Med NAM behandling, har vi været i stand til at generere> 95% embryonale hjerte prækursorer og> 50% at slå cardiomyocytter fra hESCs vedligeholdes under en definerer kultur i en proces, der kan emulere humane embryonale hjerte udvikling 12. For nylig har kendt hjerte-skæbne afgørende gener blevet brugt til at transdifferentiate muse fibroblaster i postnatale slå cardiomyocytter med en lav effektivitet på <0,5% 17, 18 </ Sup>. Imidlertid har omprogrammeret somatiske celler historisk set været forbundet med unormal genekspression og accelereret ældning med nedsat terapeutisk værktøj 19-21. Endelig er den protokol, vi etableret her begrænset til pluripotente hESCs stammer fra den indre cellemasse (ICM) eller epiblast den menneskelige blastocyst 4,5, gælder måske ikke for andre pluripotente celler, herunder animalsk oprindelse økonomiske og sociale råd, økonomiske og sociale råd stammer fra tidligere morula (otte-celle)-fase embryoner 22, og kunstigt omprogrammeret celler 23.
The authors have nothing to disclose.
XHP er blevet støttet af National Institute of Health (NIH) tilskud fra National Institute on Aging (NIHK01AG024496) og The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NIHR21HD056530).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
Human laminin | Sigma | L6274 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 10565042 | |
DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
Human transferrin | Sigma | T8158 | |
Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
Defined FBS | Hyclone | SH30073-03 | |
6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
6-well plate | Corning | 3516 |