Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Kardioblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen kardialen Vorläuferzellen und funktionelle Kardiomyozyten für Herz-Kreislauf-Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.
Bis heute hat das Fehlen eines geeigneten menschlichen Herzzellen Quelle der schweren Rückschlag bei der Regeneration des menschlichen Myokard wurden, entweder durch zellbasierte Transplantation oder durch kardiale Tissue Engineering 1-3. Kardiomyozyten werden bald nach der Geburt terminal differenzierten und verlieren ihre Fähigkeit sich zu vermehren. Es gibt keine Beweise dafür, dass Stammzellen / Vorläuferzellen aus anderen Quellen, wie zB dem Knochenmark oder Nabelschnurblut gewonnen werden können, steigen die kontraktilen Herzmuskelzellen geben nach der Transplantation in das Herz 1-3. Die Notwendigkeit, sich zu regenerieren oder zu reparieren die beschädigten Herzmuskel nicht von adulten Stammzellen-Therapie, entweder endogene oder via Zelle Lieferung 1-3 erfüllt. Die genetisch stabil humanen embryonalen Stammzellen (hES) haben unbegrenzte Expansion Fähigkeit und uneingeschränkten Formbarkeit, kredenzen eine pluripotente Reservoir für in vitro Ableitung von großen Lieferungen von menschlichen Körperzellen, die die Linie in Not eingeschränkt werdender Reparatur und Regeneration 4,5. Aufgrund der Prävalenz von Herz-Kreislauf-Erkrankungen weltweit und akuten Mangel an Spenderorganen, gibt es intensives Interesse an der Entwicklung von hES-basierte Therapien als ein alternativer Ansatz. Allerdings hat, wie die breite Differenzierungspotential von pluripotenten hES effizient und vorhersagbar Kanal zu einem gewünschten Phänotyp eine große Herausforderung sowohl für Entwicklungs-Studie und klinische Übersetzung worden. Herkömmliche Ansätze beruhen auf multi-lineage Neigung von pluripotenten Zellen durch spontane Keimblatt Differenzierung, was ineffizient und unkontrollierbare Linie-Engagement, das oft durch phänotypische Heterogenität und Instabilität, damit ein hohes Risiko für Tumorigenität 6-8 (siehe schematischer in gefolgt wird Abb.. 1A). Darüber hinaus können ausländische undefined / Tier biologische Zusatzstoffe und / oder Anleger, die typischerweise für die Isolierung, Expansion und Differenzierung von hES verwendet wurden um direkte Verwendung solcher Zell-Spezialisierungzed Transplantaten in Patienten problematisch 9-11. Um diese Hindernisse zu überwinden, haben wir die Elemente einer definierten Kultur-System notwendig und hinreichend für die Erhaltung der Pluripotenz von hES Epiblast gelöst und dient als Plattform für die de novo Ableitung von klinisch-geeignet hESCs und effektiv leiten wie hESCs gleichmäßig in Richtung klinisch relevanter Linien durch kleine Moleküle 12 (siehe schematische Abb.. 1B). Nach dem Screening einer Vielzahl von kleinen Molekülen und Wachstumsfaktoren, fanden wir, dass solche definierten Bedingungen Nicotinamid (NAM) ausreichen, um die Spezifikation von cardiomesoderm direkt aus pluripotenten hES, die weiter nach Kardioblasten, dass die menschliche schlagen Kardiomyozyten mit hohem Wirkungsgrad erzeugt fortgeschritten induzieren (Abb. 2 dargestellt ). Wir definierten Bedingungen für die Induktion von Kardioblasten direkt aus pluripotenten hES ohne Zwischenschaltung einer multi-lineage Embryoidkörper Bühne, so dass gut kontrollierte effiziente Ableitung einesgroßen Vorrat an menschlichen Herzzellen im gesamten Spektrum der Entwicklungsstadien für die Zell-basierter Therapeutika.
Eine der großen Herausforderungen für Entwicklungs-Studie und klinische Umsetzung wurde, wie die breite Differenzierungspotential von pluripotenten menschlichen Stammzellen zu einem gewünschten Phänotyp effizient und vorhersagbar Kanal. Obwohl diese Zellen spontan differenzieren können in vitro in Zellen aller Keimblätter, indem Sie durch ein Multi-Linie aggregierten Stufe, in hESC-derived multi-lineage Aggregate (Embryoidkörpern), nur ein sehr kleiner Teil der Zellen (<2%) spontan Differenzierung in Herzmuskelzellen 13-15 (Abb. 1A). Nach Immunselektion wurden die angereicherte Populationen von Herzmuskelzellen in der Lage, als biologische Schrittmacher-Funktion, um die Funktion eines beschädigten Herzmuskels mechanisch und elektronisch Rettung nach der Injektion in das Herz von Tiermodellen 13. In Nagetiere Infarkt Modelle wurden eingepflanzt hESC-derived kardiale Nachkommen überleben können und reifen bis zu 12 Wochen, und teilweise remuscularize den verletzten Herzen und zur Verbesserung der kontraktilen Funktion 14,15. Allerdings haben die Ineffizienz bei der Erzeugung von menschlichen Herz-verpflichtet-Zellen durch multi-lineage Differenzierung von pluripotenten Zellen und das hohe Risiko der Tumorigenität nach der Transplantation weitere klinische Übersetzung behindert. Entwicklung von Strategien, die breite Differenzierungspotential von pluripotenten hES ausschließlich und vorhersagbar Kanal zu einem kardialen Phänotyp ist entscheidend für die Nutzung der Kraft der hESC Biologie im Herzen Feld. Um einheitlich Umwandlung von menschlichen pluripotenten Stammzellen zu einer bestimmten Linie zu erreichen, verwendeten wir eine definierte Kultur System in der Lage für die Versicherung der Proliferation von undifferenzierten hES, die Bedingungen für gut kontrollierte effiziente Induktion von pluripotenten hES ausschließlich zu identifizieren, um eine bestimmte klinisch relevante Linie durch einfache Bereitstellung von kleinen Molekülen (Abb. 1B). Wir fanden, dass Nicotinamid induzierten Herz-Linie Engagement direkt bei pluripotent hESCs unter definierten Kultur, die weiter fortgeschritten zu schlagen Kardiomyozyten mit hohem Wirkungsgrad (Abb. 2). Nkx2.5 ist ein evolutionär konservierter homeobox Transkriptionsfaktor für normale kardiale Entwicklung und Mutationen des Gens unerlässlich sind mit menschlichen angeborenen Herzkrankheit (KHK), der häufigsten menschlichen Geburtsfehler 16 zugeordnet. Expression von Nkx2.5 ist der früheste Marker für Herz-Vorläuferzellen in allen Wirbeltieren so weit untersucht und ist essentiell für die richtige Herz-Septierung und Bildung / Reifung der elektrischen Leitung System 16. Bei Wirbeltieren, den Beginn und das Muster der frühen Nkx2.5 Ausdruck etwa mit dem Timing und des kardialen Spezifikation in der frühen Embryogenese zusammenfallen, und Nkx2.5 Gens weiterhin durch die Entwicklung in der Herz 16 ausgedrückt werden. In unserem hESC Modell erschien NAM zur kardialen Induktion direkt aus pluripotenten hES durch die Förderung der Expression von Herz-spezifische transcri auslösenption Faktor Nkx2.5 in einem Prozess, der Spezifikation der cardiomesoderm aus der pluripotenten Epiblast in humanen embryonalen Kardiogenese könnte emulieren. Zukünftige Studien werden genetische und epigenetische Kontrolle Moleküle in menschlichen Herzens Entwicklung zeigen, als Alternativen, die den Weg für kleines Molekül-vermittelten direkten Kontrolle und Modulation der hESC pluripotent Schicksal bereiten bei der Ableitung von klinisch relevanten Linien für regenerative Therapien. Ohne NAM Behandlung wird <2% hESCs spontane Differenzierung zu schlagen Kardiomyozyten 12-15 unterziehen. Mit NAM Behandlung haben wir in der Lage,> 95% embryonale Herz-Vorstufen und> 50% schlagen Kardiomyozyten aus hES unter define Kultur in einem Prozess, menschliche embryonale Herz Entwicklung 12 emulieren könnte aufrechterhalten zu generieren. Kürzlich haben die bekannten Herz-Schicksal bestimmen Gene verwendet worden, um Maus-Fibroblasten in der postnatalen schlagen Kardiomyozyten mit einem niedrigen Wirkungsgrad von <0,5% 17, 18 transdifferenzieren </ Sup>. Allerdings haben umprogrammiert Körperzellen historisch mit abnormen Genexpression und beschleunigte Seneszenz mit eingeschränkter therapeutischen Nutzen 19-21 in Verbindung gebracht. Schließlich ist das Protokoll, gründeten wir hier, um pluripotente hES aus der inneren Zellmasse (ICM) oder Epiblast des menschlichen Blastozyste 4,5 abgeleitet begrenzt, darf nicht auf andere pluripotente Zellen, einschließlich Tier-Ursprung WSR WSR aus früheren Morula abgeleitet sind (Acht-Zell)-Embryonen 22 und künstlich reprogrammierten Zellen 23.
The authors have nothing to disclose.
XHP wurde von National Institute of Health (NIH) Zuschüsse aus National Institute on Aging (NIHK01AG024496) und The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NIHR21HD056530) unterstützt.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
Human laminin | Sigma | L6274 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 10565042 | |
DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
Human transferrin | Sigma | T8158 | |
Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
Defined FBS | Hyclone | SH30073-03 | |
6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
6-well plate | Corning | 3516 |