Tracking neutrofielen intraluminale Crawling, transendotheliale migratie en chemotaxis in weefsel door intravitale Video Microscopie
Summary
Beschrijven we een protocol van helderveld intravitale microscopie voor het meten van dynamische neutrofiel-endotheliale cel interacties tijdens neutrofielen werving in reactie op de bron van een neutrofiel chemoattractant in vivo. Neutrofiele intraluminale kruipen, transendotheliale migratie en chemotaxis in de muis cremaster spierweefsel worden gevisualiseerd met een time-vervallen video fotografie en gevolgd met ImageJ.
Abstract
De aanwerving van circulerende leukocyten uit het bloed stroom naar het ontstoken weefsel is een cruciaal en complex proces van ontsteking 1,2. In de postcapillaire venulen van ontstoken weefsel, leukocyten in eerste instantie ketting en rol op het luminale oppervlak van venular muur. Rolling leukocyten arrestatie op endotheel en ondergaan stevige adhesie in reactie op chemokine of andere chemoattractants op het venular oppervlak. Veel aanhanger leukocyten verplaatsen van de eerste plaats van hechting aan de junctionele extravasatie site in endotheel, een proces genaamd intraluminale kruipen 3. Na kruipen, leukocyten bewegen over endotheel (transmigratie) en in extravasculaire weefsel migreren naar de bron van chemoattractant (chemotaxis) 4. Intravitale microscopie is een krachtig hulpmiddel voor het visualiseren van leukocyten-endotheliale cel interacties in vivo en onthullende cellulaire en moleculaire mechanismen van leukocyten werving 2,5. In dit rapport, bieden wij een uitgebreide beschrijving van het gebruik van helderveld microscopie intravitale te visualiseren en de gedetailleerde processen van neutrofielen rekrutering in de muis cremaster spier te bepalen in reactie op de gradiënt van een neutrofiel chemoattractant. Aan neutrofielen werving en selectie, een klein stukje van de agarose gel (~ 1 mm-3 formaat) met neutrofiel chemoaantrekkende MIP-2 (CXCL2, een CXC chemokine) of WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, een synthetisch analoog te induceren van bacteriële peptide) wordt geplaatst op het spierweefsel grenzend aan de waargenomen postcapillaire venule. Met de tijd-vervallen video-fotografie en computer software ImageJ, neutrofielen intraluminale kruipen op endotheel, neutrofiel transendotheliale migratie en de migratie en chemotaxis in het weefsel worden gevisualiseerd en bijgehouden. Dit protocol maakt een betrouwbare en kwantitatieve analyse van een groot aantal neutrofielen werving parameters, zoals intraluminale kruipen snelheid, transmigratie tijd, onthechting tijd, migratie snelheid, chemotaxis snelheid en chemotaxis index in weefsel. We laten zien dat het gebruik van dit protocol, deze neutrofielen werving parameters kunnen stabiel worden bepaald en de single cell motoriek handig bijgehouden in vivo.
Protocol
Discussion
Intravitale microscopie is een belangrijk gereedschap voor het openbaren van de cellulaire en moleculaire mechanismen van leukocyten werving tijdens de ontsteking. Kwantitatieve visualisatie voor de bepaling van leukocyten-endotheliale cel interacties in microvasculatuur van doorschijnend weefsels zoals cremaster spier-en mesenterium blijft de gouden standaard voor de toepassing van de techniek 1,5. De conventionele helderveld microscopie intravitale heeft vele unieke technische eigenschappen en de werving me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een onderzoeksbeurs van Canadian Institutes of Health Research (CIHR, MOP-86749). L. Liu is een ontvanger van CIHR New Investigator Award (MSH-95374).
Materials
Table: Materials, Specific Reagents and Equipment
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Polyethylene tubing, PE10 | Becton Dickinson | 427401 | I.D. 0.28mm × O.D. 0.61mm |
| India ink | Speedball Art | Super Black | 100% carbon black pigment-no dyes |
| Cautery | Aaron Medical | AA03 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Murine recombinant MIP-2 | R&D Systems | 452-M2 | |
| WKYMVm | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 072-12 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | Ultrapure |
| Heparin | Sigma | H-3393 | |
| Upright microscope | Olympus | BX61WI | |
| 3CCD color video camera | SONY | DXC-990 | |
| HD-DVD video recorder | LG Electronics Inc. | RH398H-M | |
| TV monitor | LG Electronics Inc. | 22LG30 | |
| Water circulator | Thermo Scientific | HAAKE DC10 | |
| Peristaltic pump | Gilson; Pharmacia | Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 | |
| Cremaster muscle board | University of Saskatchewan | Home-made |
References
- Liu, L., Kubes, P. Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action. Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).
- Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective. J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).
- Phillipson, M. Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade. J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).
- Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation. Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
- Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
- Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
- Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
- Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
- Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).
