Analisi della migrazione cresta neurale cellulare Trunk con un Modified Zigmond Assay Camera

Summary

Un approccio per analizzare la migrazione delle cellule espiantate (cellule della cresta neurale tronco) è descritto. Questo metodo è poco costoso, delicato, e in grado di distinguere la chemiotassi sia da chemochinesi e altre influenze sulla polarità dei migratori come quelli derivati ​​da interazioni cellula-cellula all'interno della principale coltura cresta neurale delle cellule del tronco.

Abstract

Cellule della cresta neurale (CNC) sono una popolazione transitoria di cellule presenti nello sviluppo dei vertebrati che emigrano dal tubo neurale dorsale (NT), dopo aver subito un epitelio-mesenchimale ^1,2 transizione. A seguito di EMT, CNC migrare grandi distanze lungo percorsi stereotipati fino a raggiungere i loro obiettivi. CNC differenziarsi in una vasta gamma di tipi di cellule tra cui i neuroni, glia, melanociti e cellule cromaffini ^1-3. La capacità di CNC di raggiungere e riconoscere i loro percorsi di destinazione corretta è fondamentale per la formazione adeguata di tutte le strutture contenenti tronco NCC-derivato componenti ^3. Chiarire i meccanismi di orientamento per la linea esterna NCC la migrazione è stata quindi una questione di grande importanza. Numerose molecole hanno dimostrato di guidare la migrazione NCC ^4. Per esempio, CNC tronco sono noti per essere respinti da stimoli negativi come orientamento semaforina, efrina, e leganti a fessura ^5-8. Tuttavia, nonfino a poco tempo eventuali fattori chemiotattici di CNC tronco stati identificati ^9.

Convenzionale negli approcci in vitro per lo studio del comportamento chemiotattico di cellule aderenti funzionare al meglio con le cellule immortalizzate, omogeneamente distribuiti, ma sono più difficili da applicare alle colture primarie di cellule staminali determinate che inizialmente non hanno una distribuzione omogenea e differenziano rapidamente (ad esempio CNC). Un approccio per omogeneizzare la distribuzione di CNC tronco per gli studi di chemiotassi è quello di isolare CNC tronco da colture primarie di espianti NT, quindi sollevare e replate loro di essere quasi al 100% confluenti. Tuttavia, questo approccio placcatura richiede notevoli quantità di tempo e fatica per espiantare numero sufficiente di cellule, è dura, e distribuisce CNC tronco in modo dissimile da quella che si trova nelle condizioni in vivo.

Qui, segnaliamo un approccio in vitro che è in grado di valutare le risposte migratori chemiotassi e altre NCCs tronco senza requiringa distribuzione omogenea delle cellule. Questa tecnica utilizza time-lapse imaging di primario, imperturbabile CNC tronco all'interno di una Zigmond modificato camera (una camera standard di Zigmond sono descritti in un ^10). Esponendo NCCs tronco alla periferia della coltura di un gradiente chemotactant che è perpendicolare alla loro direzionalità predetto naturale, alterazioni polarità migratori indotti dal gradiente chemotactant applicata può essere rilevato. Questa tecnica è poco costoso, richiede la coltura di due soli espianti NT per trattamento replica, evita sollevamento dura cellule (come tripsinizzazione), lascia NCCs tronco in una distribuzione più simile a condizioni in vivo, riduce la quantità di tempo tra espianto e sperimentazione (probabile che riduce il rischio di differenziazione), e permette time-lapse valutazione di numerose caratteristiche migratori.

Protocol

1. Giorno 1: Isolamento di tubi tronco neurali per la cultura durante la notte su vetrini Incubare le uova pulcino per 56 ore a 38 ° C. Togliere le uova da incubazione, leggermente spruzzateli con etanolo al 70%, e poi lasciarle asciugare. Rompete le uova si schiudono in un vassoio di vetro UV-sterilizzati. Estrarre ogni embrione dal suo uovo e metterlo nella pulcino Ringer. A tale scopo, primo taglio circa le sue isole di sangue con le forbici curve, poi, con una pinza smussato, prendere l'emb…

Discussion

Condurre ricerche sulla chemiotassi CNC tronco si è dimostrato difficile per una serie di ragioni. CNC Trunk costituiscono una eterogenea popolazione di cellule staminali che si differenziano, se coltivate a lungo termine, pertanto, CNC tronco devono essere ottenuti da espianto primario del tronco a livello di NT. I metodi convenzionali per studiare la risposta chemiotattica di popolazioni cellulari distribuiti omogeneamente in vitro sono difficili da testare su NCCs tronco dal loro primo richiedono che le cel…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
DMEM	Omega Scientific	DM-22
Penicillin Streptomycin Solution	Omega Scientific	PS-20	100X Stock Concentration
L-Glutamine	Omega Scientific	GS-60	100X Stock Concentration
Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	FB-11	Lot# 105247 (or another that is comparable)
Modified Zigmond chamber	Home made	N/A	Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol
Cell culture dish	Denville	T6040	40 x 10 mm
Fibronectin	BD	354008	10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM
Coverslips	Fisher	12-548-B	Precleaned; 22 x 22 mm
L15 medium	Thermo Scientific	SH30525.02
Petroleum Jelly	Comforts	011110794642	100%
Centrifuge tube	Biologix	10-9152	15 ml
Dispase	Cell Systems	4Z0-850	10X Stock Concentration
Syringe	BD	309602	1 ml
Needle	BD	305127	25 G x 1.5 in.
Alexa Fluor 488-IgM	Invitrogen	A21042	Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM
Dissecting Forceps	FST	Misc.	Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium
Tungsten Needle	N/A	N/A	Home made; placed in a pin holder
Blunt Forceps	Tiemann	160-18	Used for transferring embryos to Ringer’s from egg yolk

Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber

Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:

1. Purchase a sheet of 3/16″ thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness).
2. Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining.
3. Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4″) end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm.
4. Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location.
5. Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height.
6. Using a 3.91 mm (0.154″) end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300″) and then traverse to 7.62 mm (0.300″) in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600″). Offset the bit to 3.03 mm (0.119″) along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir.
7. Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation.
8. Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants.
9. Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.