Analyse van Trunk neurale cel migratie met behulp van een gewijzigd Zigmond Kamer Assay

Summary

Een benadering om de migratie van cellen geëxplanteerde (trunk neurale cellen) analyseren beschreven. Deze methode is goedkoop, zacht en kunnen onderscheiden chemotaxis van zowel chemokinesis en andere invloeden op trekkende polariteit zoals die afgeleid van cel-cel interacties in de primaire neurale stam celkweek.

Abstract

Neurale cellen (NCC) een voorbijgaande populatie van cellen in de ontwikkeling van vertebraten die uit de dorsale neurale buis (NT) NZ na het ondergaan van een epitheliale-mesenchymale transitie ^1,2. Na EMT, NCC's migreren grote afstanden langs stereotype paden totdat ze hun doelstellingen. NCC's differentiëren tot een breed scala aan celtypes waaronder neuronen, glia, melanocyten, en chromaffin cellen ^1-3. Het vermogen van NCC's te bereiken en herkennen hun juiste doellocaties is fundamenteel voor de juiste vorming van alle structuren die trunk NCC-afgeleide componenten ^3. Het ophelderen van de mechanismen van begeleiding voor romp NCC migratie is dan ook een kwestie van grote betekenis. Talrijke moleculen zijn gebleken NCC migratie ⁴ leiden. Zo worden trunk NCC's bekend te worden afgestoten door negatieve begeleiding signalen zoals Semaphorin, Efrine, en Slit liganden ^5-8. Echter niettot voor kort geen chemoattractanten van stam NCC geïdentificeerd ^9.

Conventionele benaderingen in vitro bestuderen van het gedrag van chemotactische hechtende cellen werken beste geïmmortaliseerd, homogeen verdeeld cellen, maar moeilijker om voor bepaalde primaire stamcelculturen die aanvankelijk missen een homogene verdeling en snel differentiëren (bijvoorbeeld NCC). Een benadering voor de verdeling van stam NCC voor chemotaxis studies meng is trunk NCC isoleren van primaire NT explantaat culturen til en replate ze bijna 100% confluent. Echter, deze plating aanpak vereist aanzienlijke hoeveelheden tijd en moeite om voldoende cellen explanteren, is hard, en distribueert romp nationale centra voor valsemunterij op een ongelijke wijze als in in vivo omstandigheden.

Hier rapporteren we een in vitro methode die in staat is chemotaxis en andere migrerende reacties van stam NCC evalueren zonder requirinGA homogene cel distributie. Deze techniek maakt gebruik van time-lapse imaging van de primaire, romp NCC onverstoord in een gemodificeerde Zigmond kamer (een standaard Zigmond kamer wordt elders ¹⁰ beschreven). Door belichting stam NCC aan de omtrek van de cultuur een chemotactant gradiënt loodrecht op hun voorspelde natuurlijke richtinggevoeligheid kunnen veranderingen in trekkende polariteit opgewekt door de toegepaste gradiënt chemotactant worden gedetecteerd. Deze techniek is goedkoop, vereist het kweken van twee NT explantaten per herhaling behandeling vermijdt harde cel heffen (zoals trypsine), bladeren trunk NCC in een soortgelijke verdeling in vivo omstandigheden, vermindert de hoeveelheid tijd tussen explantatie en experimenten (waardoor waarschijnlijk het risico van differentiatie), en maakt time-lapse evaluatie van talrijke trekkende eigenschappen.

Protocol

1. Dag 1: Isolatie van de romp neurale buizen voor overnachting cultuur op dekglaasjes Incubeer chick eieren voor 56 uur bij 38 ° C. De eieren Verwijderen uit incubatie, licht besproeien ze met 70% Ethanol en laat ze drogen. Breek de eieren open in een UV-gesteriliseerde glazen draaiplateau. Uittreksel elk embryo uit de dooier en plaats deze in kuiken Ringer's. Doe dit door eerst snijden rond zijn bloed eilanden met gebogen schaar, vandaar met stompe pincet, pak het embryo door de extra-embryon…

Discussion

Het uitvoeren van chemotaxis onderzoek op stam NCC heeft bewezen een uitdaging voor een aantal redenen. Trunk NCC's vormen een heterogene stamcel populatie die zal differentiëren als gekweekte lange termijn, daarom romp NCC's moet worden verkregen van de primaire explantatie van de stam-niveau NT. Conventionele methoden om de chemotactische respons van homogeen verdeeld celpopulaties in vitro bestuderen zijn moeilijk te testen op stam NCC omdat ze eerst dient cellen geïsoleerd en homogeen opnieuw uitg…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
DMEM	Omega Scientific	DM-22
Penicillin Streptomycin Solution	Omega Scientific	PS-20	100X Stock Concentration
L-Glutamine	Omega Scientific	GS-60	100X Stock Concentration
Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	FB-11	Lot# 105247 (or another that is comparable)
Modified Zigmond chamber	Home made	N/A	Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol
Cell culture dish	Denville	T6040	40 x 10 mm
Fibronectin	BD	354008	10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM
Coverslips	Fisher	12-548-B	Precleaned; 22 x 22 mm
L15 medium	Thermo Scientific	SH30525.02
Petroleum Jelly	Comforts	011110794642	100%
Centrifuge tube	Biologix	10-9152	15 ml
Dispase	Cell Systems	4Z0-850	10X Stock Concentration
Syringe	BD	309602	1 ml
Needle	BD	305127	25 G x 1.5 in.
Alexa Fluor 488-IgM	Invitrogen	A21042	Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM
Dissecting Forceps	FST	Misc.	Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium
Tungsten Needle	N/A	N/A	Home made; placed in a pin holder
Blunt Forceps	Tiemann	160-18	Used for transferring embryos to Ringer’s from egg yolk

Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber

Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:

1. Purchase a sheet of 3/16″ thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness).
2. Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining.
3. Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4″) end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm.
4. Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location.
5. Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height.
6. Using a 3.91 mm (0.154″) end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300″) and then traverse to 7.62 mm (0.300″) in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600″). Offset the bit to 3.03 mm (0.119″) along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir.
7. Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation.
8. Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants.
9. Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.