Bir Modifiye Zigmond Odası Testi kullanılarak Trunk Sinir Crest Hücre Göç Analizi

Summary

Eksplante hücreleri (gövde nöral krest hücreleri) göçü analiz etmek bir yaklaşım tarif edilmiştir. Bu yöntem, pahalı yumuşak, ve bu gibi ana gövde tepe nöral hücre kültürü içinde hücre-hücre etkileşimleri türetilmiş olanlar gibi, göç polarite hem chemokinesis ve diğer etkilerden kemotaksisi ayrım yapabilmektedir.

Abstract

Nöral krest hücrelerinden (NCCS) epitelyal-mezenkimal geçiş ^1,2 geçirildikten sonra dorsal nöral tüp (NT) göç omurgalı gelişimi mevcut hücrelerin geçici bir nüfusu vardır. Onların hedeflerine ulaşana kadar EMT ardından NCCS stereotipik yollar boyunca büyük mesafeler göç. NCCS nöronlar, glia, melanosit ve ^1-3 kromaffin hücreleri de içeren farklı hücre tipleri geniş bir dizi farklılaşırlar. Onların doğru hedef konumlarına ulaşmak ve tanımak NCCS yeteneği gövde bileşenleri ³ NCC-türetilmiş içeren tüm yapıların uygun oluşumu için temel olduğunu. Gövde KKK göç için rehberlik mekanizmalarının aydınlatılmasına dolayısıyla büyük önem taşıyan bir konu olmuştur. Sayısız molekülleri KKK göç ⁴ yol gösterilmiştir. Örneğin, gövde NCCS bu tür Semaphorin, efrin ve yarık ligandları olarak ^5-8 negatif kılavuz işaretler tarafından uzaklaştırılacaktır bilinmektedir. Ancak,Son zamanlarda gövde NCCS ⁹ belirlenmiştir herhangi chemoattractants kadar.

Yapışık hücrelerin kemotaktik davranışlarını incelemek üzere in vitro yaklaşımlar Konvansiyonel ölümsüzleştirdiği, homojen dağıldığı hücreler en iyi şekilde çalışır, ancak başlangıçta homojen bir dağılım eksikliği ve hızla (örneğin NCCS gibi) ayırt bazı primer kök hücre kültürleri uygulamak daha zor. Kemotaksisi çalışmaları için gövde NCCS dağılımı homojenize Bir yaklaşım birincil NT eksplant kültürlerden gelen gövde NCCS izole etmektir, sonra kaldırın ve onları neredeyse% 100 konfluent olmak replate. Ancak, bu kaplama yaklaşım, zaman ve yeterli hücre eksplantasyona çaba önemli miktarda gerektirir sert olduğunu, ve in vivo koşullarda bulunan bir farklı şekilde gövde NCCS dağıtır.

Burada, requirin olmadan gövde NCCS arasında kemotaksis ve diğer göçmen yanıtları değerlendirmek mümkün bir in vitro yaklaşımı raporhomojen hücre dağılımı ga. Bu teknik, primer time-lapse görüntüleme kullanan bir modifiye Zigmond odası (standart Zigmond odası başka bir yerde ¹⁰ açıklanan) iç gövde NCCS soğukkanlı. Bunların tahmin edilen doğal yön dik bir chemotactant gradyanı ile kültür çevresinde yer alan gövde NCCS açığa olarak, uygulanan chemotactant gradyanı ile oluşturulan göç polarite değişiklikler tespit edilebilir. Bu teknik, ucuz çoğaltma tedavi başına sadece iki NT eksplant kültür gerektirir, sert hücre kaldırma (örneğin tripsinizasyonla gibi) önler vivo koşullarda bir daha benzer dağılımda gövde NCCS bırakır eksplantasyonunun ve deneme arasındaki süreyi aşağı kesim (hangi büyük olasılıkla farklılaşma riskini azaltır), ve çok sayıda göçmen özellikleri time-lapse değerlendirilmesine olanak tanımaktadır.

Protocol

1. 1. Gün: lamelleri gecede kültür gövde nöral tüp İzolasyonu 38 az 56 saat süreyle civciv yumurta inkübe ° C inkübasyon yumurta çıkarın, hafif% 70 Etanol ile onları sprey, ve sonra onları kurutun. UV-steril cam tepsi içine açık yumurtaları kırın. Sarisi her embriyo ayıklayın ve civciv Ringer yerleştirin. Kavisli makas ile kan adaların etrafında ilk kesim tarafından bu yapın; ardından, künt forseps ile, onun extraembryonic zarla embriyo pick up ve civciv Ringer çözel…

Discussion

Gövde NCCS üzerine kemotaksis araştırmaların yapılması nedenlerle bir dizi için zor olduğu kanıtlanmıştır. Bu nedenle, gövde NCCS gövde düzeyinde NT birincil eksplantasyonunun alınmalıdır; Trunk NCCS kültürlü uzun vadede ise farklılaştıracak bir heterojen kök hücre popülasyonu oluşturur. In vitro homojen dağıldığı hücre popülasyonlarının kemotaktik yanıtı incelemek için konvansiyonel yöntemler onlar ilk hücreler izole ve kemotaksis odası (örneğin, bir Boyden çember…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
DMEM	Omega Scientific	DM-22
Penicillin Streptomycin Solution	Omega Scientific	PS-20	100X Stock Concentration
L-Glutamine	Omega Scientific	GS-60	100X Stock Concentration
Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	FB-11	Lot# 105247 (or another that is comparable)
Modified Zigmond chamber	Home made	N/A	Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol
Cell culture dish	Denville	T6040	40 x 10 mm
Fibronectin	BD	354008	10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM
Coverslips	Fisher	12-548-B	Precleaned; 22 x 22 mm
L15 medium	Thermo Scientific	SH30525.02
Petroleum Jelly	Comforts	011110794642	100%
Centrifuge tube	Biologix	10-9152	15 ml
Dispase	Cell Systems	4Z0-850	10X Stock Concentration
Syringe	BD	309602	1 ml
Needle	BD	305127	25 G x 1.5 in.
Alexa Fluor 488-IgM	Invitrogen	A21042	Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM
Dissecting Forceps	FST	Misc.	Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium
Tungsten Needle	N/A	N/A	Home made; placed in a pin holder
Blunt Forceps	Tiemann	160-18	Used for transferring embryos to Ringer’s from egg yolk

Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber

Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:

1. Purchase a sheet of 3/16″ thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness).
2. Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining.
3. Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4″) end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm.
4. Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location.
5. Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height.
6. Using a 3.91 mm (0.154″) end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300″) and then traverse to 7.62 mm (0.300″) in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600″). Offset the bit to 3.03 mm (0.119″) along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir.
7. Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation.
8. Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants.
9. Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.