A Functional Whole Blood Assay zur Rentabilität von Mykobakterien Measure, mit Reporter-Gene BCG oder M. Tb (BCG Tagged Lux / M. Tb Lux)

Summary

Wir beschreiben einen alternativen Ansatz, um die Auszählung von Mykobakterien<em> In-vitro-</em>, Die Reporter-Gen verwendet getaggt Mykobakterien statt Kolonie-bildenden Einheiten (KBE). "Survival" von Organismen sowie Host-Reaktion-Marker sind gleichzeitig gemessen Bereitstellung eines kostengünstigen, vielseitig und funktionsfähiges System für Untersuchungen der Wirt / Pathogen-Interaktionen im Rahmen der Tuberkulose.

Abstract

Funktionale Tests sind seit langem eine wichtige Rolle bei der Messung der Immunogenität eines bestimmten Impfstoff gespielt. Dies wird üblicherweise als Serum bakterizide Titer ausgedrückt. Studium der Serum bakterizide Titer in Reaktion auf Impfstoffen für Kinder haben es uns zur Entwicklung und Validierung cut-off Werte für schützende Immunantworten und wie cut-offs sind in den Routineeinsatz. Keine solche Assays wurden nach vorne in die Routine Beurteilung von Impfstoffen, die vor allem die zellvermittelte Immunität in Form von Effektor-T-Zell-Reaktionen, wie z. B. TB-Impfstoffe induzieren genommen. Im Tiermodell ist die Leistung eines bestimmten Impfstoff routinemäßig in standardisierten bakterizide Assays ausgewertet und alle aktuellen Roman TB-Impfstoff-Kandidaten haben diesen Schritt in ihrer Auswertung wurden die vor dem 1. Humanstudien Phase unterzogen. Die Beurteilung der Immunogenität und damit die Wahrscheinlichkeit der Schutzwirkung von neuartigen Anti-TB-Impfstoffe sollten im Idealfall durchlaufen eine ähnliche stufenweise Auswertung in der menschlichen Modellen nun auch eine Bestimmung in bakterizide Assays.

Bakterizide Assays im Rahmen der Tuberkulose Impfstoff-Forschung sind bereits gut in den Tiermodellen etabliert, wo sie angewendet werden, um potenziell vielversprechenden Impfstoffkandidaten Bildschirm. Reduzierung der bakteriellen Belastung in verschiedenen Organen Funktionen wie die wichtigsten Auslesen der Immunogenität. Es wurden jedoch keine solchen Tests in klinischen Studien für neue Anti-TB-Impfstoffe bisher einbezogen.

Zwar gibt es noch Ungewissheit über die genauen Mechanismen, die von Mykobakterien in humanen Makrophagen töten führen, ist die Interaktion von Makrophagen und T-Zellen mit Mykobakterien eindeutig erforderlich. Der Test in diesem Papier beschrieben stellt eine neuartige Generation von bakterizide Assays, die Untersuchungen solcher Schlüssel zellulären Komponenten ermöglicht mit allen anderen zellulären und humoralen Faktoren, die in Vollblut ohne Annahmen bezüglich ihrer relativen individuellen Beitrag. Der Test von unserer Gruppe beschrieben werden kleine Mengen von Blut und hat bereits in Studien an Erwachsenen und Kindern in TB-endemischen Einstellungen eingesetzt. Wir haben Immunogenität des BCG-Impfstoffes gezeigt, erhöhtes Wachstum von Mykobakterien bei HIV-positiven Patienten, sowie die Wirkung von anti-retroviralen Therapie und Vitamin D auf Mykobakterien Überleben in vitro. Hier fassen wir die Methodik, und präsentieren Ihnen unsere Reproduzierbarkeit Daten mit diesem relativ einfachen, kostengünstigen und Feld-freundlichen Modell.

Hinweis: Definitionen / Abkürzungen

BCG lux = M. bovis BCG, Montreal Belastung, mit Shuttle-Plasmid pSMT1 Durchführung der luxAB Gene von Vibrio harveyi verwandelt, die unter der Kontrolle der Mykobakterien GroEL (Hsp60)-Promotor.
KBE = Kolonie bildende Einheiten (ein Maß für Mykobakterien Lebensfähigkeit).

Protocol

1. Vorbereitung der BCG lux Reporter Mykobakterien Lager Wachsen BCG lux (M. bovis BCG Montreal Stamm mit dem Shuttle-Plasmid pSMT1 umgewandelt) unter Schütteln bei 200rpm bis Mitte logarithmischen Phase in Middlebrook 7H9-Bouillon mit 0,2% Glycerin, 0,05% zwischen 80 und 10% ADC Bereicherung. Bereiten Sie 1 ml einer 1:10-Verdünnung von BCG lux Kultur in sterile PBS in einem Luminometer Rohr (900μl PBS + 100 &mgr; BCG lux Kultur) in zweifacher Ausfertigung….

Discussion

Bakterizide Assays im Rahmen der Tuberkulose Impfstoff-Forschung sind auch in Tiermodellen etabliert, wo sie angewendet werden, um potenziell vielversprechenden Impfstoffkandidaten Bildschirm. Reduzierung der bakteriellen Belastung in verschiedenen Organen Funktionen wie die wichtigsten Auslesen der Immunogenität.

Die erste Generation von Menschen bakterizide Assays wurden unter Verwendung Makrophagen allein, infiziert mit M. Tuberkulose. CFU diente als Haupt-Auslesen von Mykobakte…

Materials

Reagent	Company	Cat No
BCG lux	Various	n/a
Middlebrook 7H11 agar	Becton Dickinson	283810
Middlebrook 7H9 broth	BD Biosciences	271310 (500g)
Middlebrook ADC enrichment	BD Biosciences	212352
Middlebrook OADC supplement	Becton Dickinson	212240
Tween 80	Sigma Aldrich	274364
Glycerol	Sigma Aldrich	G5150
Hygromycin B	Roche	10843555001 (20ml)
N-decyl aldehyde	Sigma	D7384-100G
Ethanol (>99.7%)	VWR	101077
Sterile PBS	In House	n/a
RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES	Sigma	R0883
Sterile distilled Water	In House	n/a
Equipment
Tube luminometer (injectable port mandatory)	Berthold AutoLumat LB953 or single-tube luminometer Sirius
Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless	Corning from VWR	99445-12
Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml	Corning via Fisher Scientific	2150329
BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin)	BD	367676
50ml Falcon tubes, conical	BD	352077
7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes	VWR	99445-12
Sterilin Universal containers (30 ml)	Laboratory Analysis LTD	128C
Glass beads 2mm diameter	SigmaAldrich	Z143928
10ml pipettes and pipette boy	any
1000μl and 200μl pipettes and filter tips	any
General laboratory equipment:
Class II safety cabinet cabinet
Refrigerator (4°C)
Centrifuge
Rocking shaker platform (1800) to mix tubes
Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures