BCGまたはM. TB（BCGタグレポーター遺伝子を用いて、抗酸菌の生存率を測定するための機能全血アッセイルクス / M. Tbをルクス）
Summary
我々は、マイコバクテリアの列挙に別のアプローチを説明します<em> in vitroで</emコロニー形成単位（CFU）の代わりに抗酸菌タグ付けされたレポーター遺伝子を使用する>、。生物の"生存"だけでなく、宿主応答 – マーカーが結核のコンテキストでのホスト/病原体相互作用の研究のための低コスト、汎用性と機能的なシステムを提供し、同時に測定されています。
Abstract
機能アッセイは、長い間、特定のワクチンの免疫原性を測定する際に重要な役割を果たしてきました。これは、従来、血清殺菌力価として表されます。幼年期のワクチンへの応答における血清殺菌力価の研究は、防御免疫応答と、カットオフのためにカットオフレベルを開発し、検証するために私たちを有効にしているルーチンを使用しています。そのようなアッセイは、このような結核ワクチンなどのエフェクターT細胞応答の形で主に細胞性免疫を誘導するワクチンのルーチン評価に前方に取られている。動物モデルでは、与えられたワクチン候補のパフォーマンスは、日常的に標準化された殺菌アッセイで評価され、現在のすべての小説TB -ワクチン候補は、1人間の臨床試験を段階的に廃止する前に、彼らの評価では、この工程に供されています。免疫原性とそのため新規抗結核ワクチンの予防効果の可能性の評価は、理想的に殺菌アッセイで測定を含む、現在は人間のモデルに類似した段階的な評価を受けるべきである。
結核ワクチン研究の文脈における殺菌アッセイは、既によく、それらが潜在的に有望なワクチン候補をスクリーニングするために適用される動物モデル、年に設立されています。免疫原性の読み出しメインとして様々な臓器の機能の細菌負荷の低減。しかし、そのようなアッセイは、これまでの新規抗結核ワクチンの臨床試験に組み込まれていません。
ヒトマクロファージ内部のマイコバクテリアの死滅につながる正確なメカニズムについての不確実性が依然としてあるものの、抗酸菌とマクロファージとT細胞の相互作用が明らかに必要です。このホワイトペーパーに記載のアッセイは、それらの相対的な個々の貢献についての仮定を行うことなく、全血中に存在するすべての他の細胞性および体液性因子とそのような重要な細胞成分の研究を可能にする殺菌アッセイの小説世代を表します。私たちのグループによって記述されるアッセイは、全血の少量を使用し、既に結核流行の設定で、大人と子供の研究で用いられている。我々は、BCGワクチンの免疫原性を示すHIV陽性患者におけるマイコバクテリアの成長だけでなく、in vitroでの抗酸菌の生存に対する抗レトロウイルス療法とビタミンDの効果を増加している。ここでは、方法論を要約し、そしてこの比較的単純な、低コストとフィールドフレンドリーなモデルを使用して、私たちの再現性のデータを提示する。
注：定義/略語
BCG ルクス = M.ウシ型 BCG、モントリオールの株は、抗酸菌のGroEL（HSP60）のプロモーターの制御下で、 ビブリオharveyiからluxAB遺伝子を有するシャトルプラスミドpSMT1で形質転換。
CFU =コロニー形成単位（マイコバクテリア生存率の測定）。
Protocol
Discussion
結核ワクチン研究の文脈における殺菌アッセイは、それらが潜在的に有望なワクチン候補をスクリーニングするために適用される動物モデル、年に設立されています。免疫原性の読み出しメインとして様々な臓器の機能の細菌負荷の低減。
人間の殺菌アッセイの第一世代はM.に感染し、単独でマクロファージを用いて設計され結核 。 CFUは、3週間の最小時間…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ウェルカムトラストからベアテKampmann（056608、GRO77273）への個人的な奨学金によって賄われていた。
Materials
| Reagent | Company | Cat No |
| BCG lux | Various | n/a |
| Middlebrook 7H11 agar | Becton Dickinson | 283810 |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Biosciences | 271310 (500g) |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Biosciences | 212352 |
| Middlebrook OADC supplement | Becton Dickinson | 212240 |
| Tween 80 | Sigma Aldrich | 274364 |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5150 |
| Hygromycin B | Roche | 10843555001 (20ml) |
| N-decyl aldehyde | Sigma | D7384-100G |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 101077 |
| Sterile PBS | In House | n/a |
| RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES | Sigma | R0883 |
| Sterile distilled Water | In House | n/a |
| Equipment | ||
| Tube luminometer (injectable port mandatory) | Berthold AutoLumat LB953 or single-tube luminometer Sirius | |
| Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless | Corning from VWR | 99445-12 |
| Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml | Corning via Fisher Scientific | 2150329 |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin) | BD | 367676 |
| 50ml Falcon tubes, conical | BD | 352077 |
| 7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes | VWR | 99445-12 |
| Sterilin Universal containers (30 ml) | Laboratory Analysis LTD | 128C |
| Glass beads 2mm diameter | SigmaAldrich | Z143928 |
| 10ml pipettes and pipette boy | any | |
| 1000μl and 200μl pipettes and filter tips | any | |
| General laboratory equipment: | ||
| Class II safety cabinet cabinet | ||
| Refrigerator (4°C) | ||
| Centrifuge | ||
| Rocking shaker platform (1800) to mix tubes | ||
| Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures | ||
References
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