प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रात्मक immunofluorescence का उपयोग ट्यूमर में विविधता मानचित्रण
Summary
यहाँ हम एक मात्रात्मक immunofluorescence, छवि विश्लेषण, और विविधता के एक सांख्यिकीय माप का उपयोग कर ट्यूमर सामग्री के histological वर्गों में आणविक विविधता यों विधि का वर्णन. विधि नैदानिक biomarker विकास और विश्लेषण में उपयोग के लिए इरादा है.
Abstract
Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of areas of distinct differentiation into recognized histological subtypes, or different pathological grade, often there are more subtle differences in phenotype which defy accurate classification (Figure 1). Ultimately, since morphology is dictated by the underlying molecular phenotype, areas with visible differences are likely to be accompanied by differences in the expression of proteins which orchestrate cellular function and behavior, and therefore, appearance. The significance of visible and invisible (molecular) heterogeneity for prognosis is unknown, but recent evidence suggests that, at least at the genetic level, heterogeneity exists in the primary tumor1,2, and some of these sub-clones give rise to metastatic (and therefore lethal) disease.
Moreover, some proteins are measured as biomarkers because they are the targets of therapy (for instance ER and HER2 for tamoxifen and trastuzumab (Herceptin), respectively). If these proteins show variable expression within a tumor then therapeutic responses may also be variable. The widely used histopathologic scoring schemes for immunohistochemistry either ignore, or numerically homogenize the quantification of protein expression. Similarly, in destructive techniques, where the tumor samples are homogenized (such as gene expression profiling), quantitative information can be elucidated, but spatial information is lost. Genetic heterogeneity mapping approaches in pancreatic cancer have relied either on generation of a single cell suspension3, or on macrodissection4. A recent study has used quantum dots in order to map morphologic and molecular heterogeneity in prostate cancer tissue5, providing proof of principle that morphology and molecular mapping is feasible, but falling short of quantifying the heterogeneity. Since immunohistochemistry is, at best, only semi-quantitative and subject to intra- and inter-observer bias, more sensitive and quantitative methodologies are required in order to accurately map and quantify tissue heterogeneity in situ.
We have developed and applied an experimental and statistical methodology in order to systematically quantify the heterogeneity of protein expression in whole tissue sections of tumors, based on the Automated QUantitative Analysis (AQUA) system6. Tissue sections are labeled with specific antibodies directed against cytokeratins and targets of interest, coupled to fluorophore-labeled secondary antibodies. Slides are imaged using a whole-slide fluorescence scanner. Images are subdivided into hundreds to thousands of tiles, and each tile is then assigned an AQUA score which is a measure of protein concentration within the epithelial (tumor) component of the tissue. Heatmaps are generated to represent tissue expression of the proteins and a heterogeneity score assigned, using a statistical measure of heterogeneity originally used in ecology, based on the Simpson’s biodiversity index7.
To date there have been no attempts to systematically map and quantify this variability in tandem with protein expression, in histological preparations. Here, we illustrate the first use of the method applied to ER and HER2 biomarker expression in ovarian cancer. Using this method paves the way for analyzing heterogeneity as an independent variable in studies of biomarker expression in translational studies, in order to establish the significance of heterogeneity in prognosis and prediction of responses to therapy.
Protocol
Discussion
विधि इस के साथ साथ मानक formalin-तय, आयल एम्बेडेड ट्यूमर सामग्री के histologic वर्गों में आणविक विविधता के परमिट मात्रा का ठहराव का वर्णन किया. विधि एक मूल्य के लिए एक ऊतक अनुभाग में विविधता की डिग्री के लिए आवंटित किया है, तो है कि इस biomarker विकास और विश्लेषण में एक चर के रूप में तो खाते में लिया जाना परमिट. जबकि सामान्य में यह बेहतर है कि ऊतक biomarkers अभिव्यक्ति के लिए सम्मान के साथ सजातीय हैं, ताकि परख कम नमूना त्रुटि या पूर्वाग्रह के लिए अतिसंवेदनशील है, यह कुछ परिस्थितियों में एक पैरामीटर के रूप में विविधता यों उपयोगी हो सकता है. उदाहरण के लिए, के रूप में ईआर और HER2 के लिए उदाहराणदर्शक उदाहरण में दिखाया गया है, आम biomarkers अभिव्यक्ति की काफी विविधता दिखाने के लिए और यह वर्तमान में अज्ञात है कि क्या इस नैदानिक परिणाम या उपचार के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए सम्मान के साथ एक स्वतंत्र शकुन या भविष्य कहनेवाला कारक, क्रमशः का प्रतिनिधित्व करता है. इसी तरह, के रूप में सचित्र, चिकित्सा ही गतिशील बदल सकता हैकोशिकाओं के घटक आबादी, और इसलिए लक्ष्य संवर्धन के माप इलाज के फैसले मार्गदर्शन में उपयोगी हो सकता है.
हालांकि, इस तकनीक एक ही कारक हैं जो पारंपरिक histopathological या biomarker (जैसे immunohistochemical) विश्लेषण सीमा द्वारा सीमित है. परिणाम प्रकार, आकार, और विश्लेषण किया जा रहा ऊतक की गुणवत्ता, और इसलिए एक एकल ऊतक अनुभाग पर निर्भर करता है पूरे ट्यूमर के प्रतिनिधि नहीं हो सकता. दरअसल, सिम्पसन सूचकांक अनावश्यक रूप से ऊतकों का आकार (कब्जा कर लिया और मापा एक्वा स्कोर तख्ते की संख्या) द्वारा पक्षपाती किया जा सकता है. मापा जा रहा है epitopes के प्रतिरक्षाजनकता बेकाबू पूर्व विश्लेषणात्मक कारक हैं जो artifactually ऊतक अनुभाग (जैसे ठंड ischemia समय, या निर्धारण की लंबाई, और बढ़त विरूपण साक्ष्य के रूप में) भर में उनकी अभिव्यक्ति में परिवर्तन के अधीन किया जा सकता है. यह विशेष रूप से phospho – epitopes है, जो बेहद अस्थिर 14, 15 के लिए एक समस्या है . इसलिए बेहतर अनुकूल तकनीक हो सकता हैलकीर के बजाय नमूनों छोटे बायोप्सी, और सिर्फ एक के बजाय एकाधिक अनुभागों पर प्रदर्शन. अंत में, 3 डी इमेजिंग तकनीक के लिए एक बेहतर इस पैरामीटर यों अवसर की पेशकश कर सकते हैं.
तकनीक के रूप में प्रस्तुत भी cytokeratin मास्किंग मिलान की अभिव्यक्ति में परिवर्तनशीलता के रूप में जैविक कारकों द्वारा सीमित किया जा सकता है है. उन के कैंसर में यह विशेष चिंता का विषय हो सकता है, डिम्बग्रंथि और स्तन कैंसर, जो उपकला-mesenchymal संक्रमण (EMT) से गुजरना कर रहे हैं या गैर उपकला घटकों या स्टेम सेल 16 के लिए समृद्ध सहित, के रूप में हाल ही में किया गया है के लिए होते दिखाया कीमोथेरेपी – 17 इन विट्रो में और 18 उपचार के लिए जवाब में स्तन कैंसर के रोगियों में डिम्बग्रंथि के कैंसर का इलाज किया. इस सीमा वैकल्पिक मास्किंग (या एंटीबॉडी के कॉकटेल) cytokeratin प्लस vimentin, जो 16 EMT में upregulated है जैसे एंटीबॉडी, का उपयोग कर दूर किया जा सकता है. इसके अलावा, के बाद से ऊतक के अन्य घटकों (mic) जैसे fibroblasts या संवहनी endothelial कोशिकाओं, roenvironment भी तेजी से जैविक उपचार द्वारा लक्षित कर रहे हैं किया जा रहा है, तकनीक भी करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है इन घटकों का स्कोर PECAM / CD31 के रूप में ब्याज की, डिब्बों के लिए विशेष मास्क का उपयोग करने के लिए संवहनी endothelial कोशिकाओं के लिए दाग .
हालांकि सिम्पसन सूचकांक के अनुकूलन वर्तमान प्रोटोकॉल में अपनी सादगी के कारण विविधता का एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया गया है, केंद्रीय प्रवृत्ति के सरल माप जैसे विविधता के अन्य उपाय हो सकता है, इस्तेमाल किया जा सकता (मतलब, विचरण, मंझला, आदि). इसके अतिरिक्त, सिम्पसन सूचकांक गणना करने के लिए बेहतर एक विशेष परीक्षण आबादी के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है. Z-स्कोर परिवर्तनों का उपयोग स्कोरिंग कई मार्करों के लिए लागू होने के बाद से विविधता किसी डेटा सेट के लिए यह मतलब चारों ओर विचलन पर आधारित है की अनुमति देता है. हालांकि, स्कोरिंग के समग्र श्रृंखला परिवर्तन के इस प्रकार में सीमित किया जा सकता है है. कुछ डिजाइन बेहतर उपयुक्त हो सकता हैबस एक विशेष मार्कर सेट के सभी नमूनों के लिए वास्तविक एक्वा स्कोर बिन. डिब्बे और cutoffs की संख्या का चयन मूल्यों जो परिणाम कर सकते हैं की रेंज में भी एक सीमा है और वैकल्पिक प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
हम ईआर और HER2 उम्मीदवार बायोमार्कर के रूप में वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल किया है, क्योंकि वे पहले से ही क्लिनिक में इस्तेमाल किया जाता है, लक्षित चिकित्सा की प्रभावकारिता के संबंध के साथ प्रासंगिक नैदानिक सवालों के जवाब में मदद करने के लिए, और कर रहे हैं में काफी विविधता और परिवर्तन प्रदर्शन के लिए जाना जाता प्राथमिक और दूर 19 रोग. हालांकि, विविधता के इष्टतम मार्कर के लिए निर्धारित किया है. अन्य संभावनाओं clonality के पहले अंतराप्रावस्था मछली 20 अध्ययनों में इस्तेमाल किया उन जैसे cytogenetic मार्कर, शामिल हो सकता है . बड़ी, अच्छी तरह से एनोटेट नैदानिक साथियों या नैदानिक परीक्षणों में आगे की मान्यता दृष्टिकोण की आवश्यकता है क्रम में आगे कैंसर जीव विज्ञान में इस पैरामीटर की प्रासंगिकता को स्थापित है.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
, इस काम के हिस्से में स्कॉटलैंड के अनुदान परिषद (अनुदान संख्या HR07005 द्वारा समर्थित किया गया http://www.sfc.ac.uk/ , मेडिकल रिसर्च स्कॉटलैंड () http://www.medicalresearchscotland.org.uk/ ), कैंसर रिसर्च यूके प्रायोगिक कैंसर चिकित्सा (केन्द्र http://www.cancerresearchuk.org/ ), और निर्णायक स्तन कैंसर ( http://breakthrough.org.uk/ ).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| ScanScope FL | Aperio | ScanScope FL | Used as equipped from vendor |
| Spectrum | Aperio | Spectrum | Configuration and catalog numbers will vary on how local institutions set up their database and IT structure. |
| AQUAnalysis, in conjunction with AQUAjustment | HistoRx | V2.3 | The AQUAjustment package allows AQUAnalysis to use images stored in Spectrum. |
| HER2 | Dako | A0485 | 1 in 400 dilution |
| mouse anti-pan cytokeratin | Dako | M3515 | 1 in 50 dilution |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| Envision goat-rabbit HRP | Dako | K4003 | |
| Protein block | Dako | X0909 | |
| Goat anti-mouse Alexa555 | Invitrogen | A21422 | |
| DAPI mounting medium | Invitrogen | P36931 | |
| Cy5 Tyramide | HistoRx | AQ-EMR1-00001 | |
| Sequenza Immunostaining Center | Thermo Scientific Shandon | 73300001 | Used here for bench-top immunofluorescence staining |
References
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