Spheroid Assay å måle TGF-β-indusert Invasion

Summary

En analyse for å kvantitativt måle Transforming Growth Factor (TGF)-β-indusert invasjonen i 3-dimensjonal kollagen gels er beskrevet. Denne analysen tar fordel av MCF10A rekke cellelinjer, som representerer ulike stadier av brystkreft utvikling. Denne metoden kan tas i bruk for å brukes med andre cellelinjer og kan brukes til å undersøke andre potensielle aktivatorer eller hemmere av invasjonen.

Abstract

TGF-β har motstridende roller i brystkreft progresjon ved å fungere som en tumor suppressor i den innledende fasen, men stimulerende invasjon og metastasering ved senere stadium ^1,2. Videre er TGF-β ofte overexpressed i brystkreft og dens uttrykk korrelerer med dårlig prognose og metastasering ^3,4. Mekanismer som TGF-β induserer invasjonen ikke er godt forstått.

TGF-β utløser dens cellulære responser via TGF-β type II (TβRII) og type I (TβRI) reseptorer. Ved TGF-β-indusert heteromeric kompleks formasjon, phosphorylates TβRII den TβRI. De aktiverte TβRI innleder sitt intracellulære kanoniske signalveien ved phosphorylating reseptor Smads (R-Smads), dvs. Smad2 og Smad3. Disse aktiveres R-Smads skjema heteromeric komplekser med Smad4, som akkumuleres i kjernen og regulerer transkripsjon av målet gener ^5. I tillegg til de tidligere described Smad veien, reseptor aktivering resulterer i aktivering av flere andre ikke-Smad signalveier, for eksempel mitogen Aktivert protein kinase (MAPK) veier ^6.

For å studere betydningen av TGF-β i ulike stadier av brystkreft, har vi gjort bruk av MCF10A celle system. Dette systemet består av spontant udødeliggjort MCF10A1 (M1) bryst epitelceller ^7, forvandlet H-RAS M1-derivative MCF10AneoT (M2), som produserer premaligne lesjoner i mus ^8, og M2-derivative MCF10CA1a (M4), som ble etablert fra M2 xenografts og former høy klasse karsinomer med evne til å metastasere til lungene ^9. Denne MCF10A serien tilbyr muligheten til å studere svarene av celler med ulike graderinger av malignitet som ikke er forutinntatt av en annen genetisk bakgrunn.

For analyse av TGF-β-indusert invasjon, genererte vi homotypic MCF10A Spheroid cellekulturer embedded i et 3D kollagen matrise in vitro (fig 1). Slike modeller ligner menneskelige svulster in vivo ved å etablere en gradient av oksygen og næringsstoffer, noe som resulterer i aktiv og invasive celler på utsiden og stillestående eller nekrotiske celler i innsiden av Spheroid ^10. Spheroid baserte analyser har også vist seg å bedre rekapitulere legemiddelresistens enn monolayer kulturer ^11. Denne MCF10 3D-modell system tillatt oss å undersøke virkningen av TGF-β signalering på invasive egenskaper av brystkreft celler i ulike stadier av malignitet.

Protocol

1. Utarbeidelse av methocel løsning (500 ml) Autoclave 6 g methylcellulose i en 500 ml flaske som inneholder en magnetrører. Oppløs methylcellulose i 250 ml forvarmet DMEM/F12 uten serum (60 ° C) i 20 min. Tilsett 250 ml DMEM/F12 (RT) inneholder 10% hest serum. Mix natten (4 ° C). Fjern løsningen ved sentrifugering (5000g, 2t, 4 ° C). Ta den klare svært viskøs løsning til en ny tube (ca. 90-95% av stamløsningen). Oppbevares ved 4 ° C før bruk. </l…

Discussion

Vi etablerte en Spheroid modell der MCF10A1 celler og dets ondartet derivater invadere inn en kollagen matrise i en TGF-β-avhengig måte. Først er spheroids dannet i 96-brønner rund bunn suspensjon plater i nærvær av methylcellulose. Selvfølgelig kan også U-formet poly-HEMA belagte plater brukes til dette formålet. Methylcellulose er absolutt nødvendig i dette trinnet, fordi cellene vil dø i fravær av methylcellulose. TGF-β er lagt direkte til kollagen-methocel blanding siden vi fant ut at cellene respondert…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M0512
PureCol	Advanced Biomatrix	5005-B
pH indicator strips	Merck	9533
96-well suspension plates	Greiner Bio-one	650 185
96-well adhesion TC plates	Greiner Bio-one	655 180