كشف متعددة من البكتيريا الموجودة في مجمع العينات السريرية والبيئية باستخدام قليل النوكليوتيد ، بالإضافة نيون المجهرية
Summary
نحن تصف طريقة متعددة للكشف عن الكائنات الدقيقة ضمن عينة باستخدام الخرز ، بالإضافة الفلورسنت قليل النوكليوتيد. غير المهجنة Amplicon من جميع الكائنات الحية داخل عينة على لجنة التحقيق ، إلى جانب الخرز. وتستخدم أداة أو Luminex بيو الصفيف إلى الاستعلام كل حبة حبة لنوع وإشارة التهجين.
Abstract
التهاب المهبل الجرثومي (BV) هو متلازمة متعدد المكروبات المتكررة التي يتميز تغيير في مجهريات البقعة "طبيعية" من يهيمن عليها الملبنة لمجهريات البقعة التي تهيمن عليها لعدد من أنواع البكتيريا ، بما في ذلك الغاردنريلة المهبلية ، Atopobium المهبل ، و 1-3 الآخرين. ويرتبط هذا الشرط مع مجموعة من نتائج سلبية على الصحة ، بما في ذلك اكتساب فيروس نقص المناعة البشرية 4 ، وأنه يمكن أن يكون من الصعب على إدارة سريريا 5. وعلاوة على ذلك ، اعتمد تشخيص BV على استخدام بقع غرام من المسحات المهبلية المسحة التي سجلت على معايير مختلفة 6،7 العددية. في حين أن هذا التشخيص غير بسيطة وغير مكلفة ، ويناسب المناطق ذات الموارد المحدودة ، ويمكن ان تعاني من مشاكل تتعلق التفسيرات الذاتية وأنها لا تعطي صورة تفصيلية للتكوين المهبل مجهريات البقعة 8. وقد كشفت مؤخرا جهود التسلسل عميقة ومتنوعة غنية مجهريات البقعة مع المهبليةواضح الخلافات بين عينات أخذت من الأفراد الذين يتم تشخيصهم مقارنة مع BV لأولئك الأفراد الذين يعتبرون 9،10 العادية ، مما أدى إلى تحديد عدد من الاهداف المحتملة للتشخيص الجزيئي لBV 11،12. وقد وفرت هذه الدراسات وجود ثروة من المعلومات المفيدة ، ولكن تسلسل عميق ليس بعد العملية كوسيلة تشخيصية في عملية إعداد سريرية. وقد وصفت لنا في الآونة الأخيرة وسيلة لتنميط بسرعة مجهريات البقعة المهبل في شكل متعدد باستخدام قليل النوكليوتيد ، إلى جانب الخرز الفلورسنت مع الكشف على منصة Luminex 13. هذا الأسلوب ، مثل الطرق الحالية وصمة عار على أساس غرام ، هو سريعة وبسيطة ولكنها تضيف ميزة إضافية لاستغلال المعرفة الجزيئية الناجمة عن التسلسل الدراسات في تصميم المسبار. هذا الأسلوب يوفر بالتالي وسيلة لملف كبير الكائنات الحية الدقيقة الموجودة في المسحة المهبلية التي يمكن أن تستخدم لتشخيص BV مع خصوصية عالية الحساسية وشركاتحمراء مكتوب لصبغة جرام بينما توفر معلومات إضافية حول وجود وفرة الأنواع وبطريقة شبه الكمي والسريع. هذا الأسلوب متعددة قابلة للتوسع إلى ما وراء نطاق المقايسات الحالية PCR الكمي للكائنات معينة ، والتي تقتصر حاليا على 5 أو 6 فحوصات مختلفة في عينة واحدة 14. الأهم من ذلك ، لا يقتصر على أسلوب للكشف عن البكتيريا في مسحات مهبلية ويمكن تكييفها بسهولة للملف بسرعة أي ما يقرب من المجتمع الميكروبي من الفائدة. على سبيل المثال ، بدأنا مؤخرا في تطبيق هذه المنهجية في تطوير أدوات تشخيصية للاستخدام في محطات معالجة مياه الصرف الصحي.
Protocol
Discussion
خصوصية توليد إشارة ذات أهمية حاسمة ، يجب أن تكون على ثقة من أن لاحظ إشارة تعكس حقا كشف amplicon المتولدة من ذلك الحي. يمكن لبرامج مثل PrimerPlex (الدوري Biosoft) على تصميم التحقيقات التي من شأنها أن يهجن بكفاءة ، لكنها قد تكون أو لا إلى الأنواع غير المستهدفة عبر هجن. عندما تستخدم با?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر البرتو Severini وGoleski فانيسا للمساعدة في تطوير فحص والتعليقات الهامة على هذا المخطوط. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل وكالة الصحة العامة في كندا لتقديم المساعدة وبرنامج البحوث الصناعية (المجلس القومي للبحوث في كندا). تم الحصول على دعم إضافي من جامعة ساسكاتشوان الصندوق النشر.
Materials
| Oligonucleotide name | Company | Sequence1 |
| H279BP | Invitrogen, IDT, or other | Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC |
| H280 | YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT | |
| H1612BP | Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC | |
| H1613 | CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT | |
| 1O, phosphorothioate-C; E, phosphorothioate-G; F, phosphorothioate-A; I, inosine; Y, C or T; R, A or G; K, T or G; S, C or G. | ||
Table 1. Sequences of the modified oligonucleotides for universal cpn60 PCR.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) | Pierce | 22980 | |
| Fluorescent polystyrene beads: MicroPlex Microspheres (Luminex), or Bio-Plex COOH Bead (Bio-Rad) | Luminex or Bio-Rad | Bio-Rad: 171-506xxx where xxx corresponds to the bead identifier | Magnetic beads are becoming available for oligonucleotide coupling and may offer certain advantages. Have not been tried by these authors. |
| Capture oligonucleotides (5′ amino C12 modified) | Invitrogen, IDT, or other | various | Desalted purity level is acceptable. Sequences of the capture probes used to characterize vaginal swabs are provided in the manuscript on which this protocol is based13. |
| T7 exonuclease | New England Biolabs | M0263S | |
| Streptavidin-R-phycoerythrin (SA-PE) | Invitrogen | S-866 | Be careful to obtain high purity SA-PE; this catalog number is recommended |
| Thermowell 96 well PCR plates | Fisher | CS006509 | fit into both 96-well thermocycler and BioPlex machine |
| Thermowell sealing mat | Fisher | CS006555 | Can be re-used; wash with soapy water, rinse well, and dry |
| 5M TMAC | Sigma | T3411 | |
| Bio-Plex or Luminex instrument | Bio-Rad or Luminex | Bio-Rad : 171-000201 | |
| PrimerPlex software for probe design | Premier Biosoft | www.premierbiosoft.com | Suggested for Luminex probe design, although other software platforms may be used |
Table 2. Specific reagents and equipment.
| component | μl/assay | μl/100 assays | final concentration |
| 10x PCR buffer (Invitrogen) | 5 | 500 | 1x |
| 50 mM MgCl2 (Invitrogen) | 2.5 | 250 | 2.5 mM |
| 10 mM dNTP | 1 | 100 | 0.2 mM each |
| H279BP, 25 μM | 0.25 | 25 | 375 nM |
| H1612BP, 25 μM | 0.75 | 75 | 125 nM |
| H280, 25 μM | 0.25 | 25 | 375 nM |
| H1613, 25 μM | 0.75 | 75 | 125 nM |
| Water | 34 | 3400 | — |
| Totals | 44.5 | 4450 |
Table 3. Suggested mixtures for PCR with modified cpn60 UT primers (Table 1). The assay is set up for 5 μl of template DNA and 0.5 μl (2.5U) of Taq DNA polymerase (Invitrogen). Normally large volumes are prepared (e.g. sufficient for 100 assays) and stored at -20°C.
References
- Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. Bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).
- Hay, P. Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot. Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).
- Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. Bacterial vaginosis: a public health review. Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).
- Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women’s susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms. Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).
- Wilson, J. Managing recurrent bacterial vaginosis. Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).
- Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation. J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).
- Ison, C. A., Hay, P. E. Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics. Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).
- Money, D. The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis. Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).
- Schellenberg, J. Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).
- Spear, G. T. Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis. J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).
- Brotman, R. M., Ravel, J. Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis. Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).
- Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).
- Dumonceaux, T. J. Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres. J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).
- Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics. J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).
- Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization. PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).
- Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. cpnDB: A Chaperonin Sequence Database. Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).
- Bradshaw, C. S. The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy. J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).
- Dumonceaux, T. J. Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target. J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).
