Multiplex Påvisning af Bakterier i komplekse kliniske og miljøprøver hjælp Oligonucleotid koblede Fluorescent Mikrokugler
Summary
Vi beskriver en multiplex metode til påvisning af mikroorganismer i en prøve ved hjælp oligonukleotid-koblede fluorescerende perler. Amplikon fra alle organismer i en prøve er hybridiseret til et panel af sonde-koblede perler. En Luminex eller Bio-Plex instrument bruges til at forespørge hver perle for perle type og hybridisering signal.
Abstract
Bakteriel vaginose (BV) er en tilbagevendende polymikrobiale syndrom, der er karakteriseret ved en ændring i den "normale" mikrobiota fra Lactobacillus-domineret til en mikrobiota domineret af en række bakteriearter, herunder Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, og andre 1-3. Denne betingelse er forbundet med en række negative sundhedsvirkninger, herunder hiv erhvervelse 4, og det kan være svært at håndtere klinisk 5. Endvidere har diagnosen BV har påberåbt sig brugen af Gram-farvning af vaginal podepind udstrygninger, der er scoret på forskellige numeriske kriterier 6,7. Mens denne diagnose er enkel, billig og velegnet til ressource-begrænsede indstillinger, kan det lider af problemer relateret til subjektive fortolkninger, og det giver ikke en detaljeret profil af sammensætningen af vaginal mikrobiota 8. Seneste dybe sekventering bestræbelser har afsløret en rig, varieret vaginal mikrobiota medklare forskelle mellem prøver taget fra enkeltpersoner, der er diagnosticeret med BV i forhold til de personer, der betragtes som normale 9,10, hvilket har resulteret i identifikation af en række potentielle mål for molekylær diagnostik af BV 11,12. Disse undersøgelser har givet et væld af nyttige oplysninger, men dybt sekvensering er endnu ikke praktisk som en diagnostisk metode i et klinisk miljø. Vi har for nylig beskrevet en metode til hurtigt at profilering af vaginal mikrobiota i en multiplex-format ved hjælp oligonucleotid-koblede lysstofrør perler med detektion på en Luminex platform 13. Denne metode, som den nuværende Gram-farvning-baserede metoder, er hurtig og enkel, men tilføjer yderligere fordel af at udnytte molekylær viden, der hidrører fra sekventering studier i sonde design. Denne metode giver derfor en måde at profilere store mikroorganismer, som er til stede i en vaginal podepind, der kan bruges til at diagnosticere BV med høj specificitet og følsomhed compared til Gram-farvning samtidig give yderligere oplysninger om arternes tilstedeværelse og overflod i en semi-kvantitativ og hurtig måde. Denne multipleks Metoden kan udvides langt ud over den vifte af aktuelle kvantitativ PCR assays for bestemte organismer, som for øjeblikket er begrænset til 5 eller 6 forskellige analyser i en enkelt prøve 14. Det er vigtigt, er metoden ikke begrænset til påvisning af bakterier i vaginal podninger og kan nemt tilpasses til hurtigt at profilen næsten enhver mikrobielle samfund af interesse. For eksempel har vi for nylig begyndt at anvende denne metode til udvikling af diagnostiske værktøjer til brug i renseanlæg.
Protocol
Discussion
Det særlige ved signalet generation er af afgørende betydning, og du skal være sikker på, at signalet observerede virkelig afspejler påvisning af amplikonet genereres fra den pågældende organisme. Software som PrimerPlex (Premier Biosoft) kan hjælpe med at designe sonder, der vil hybridisere effektivt, men de kan eller ikke kan på tværs af hybridisere til ikke-målarter. Når universelle PCR primere anvendes som beskrevet i denne protokol, er det vigtigt at huske på, at den genererede amplikonet repræsentere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Alberto Severini og Vanessa Goleski for hjælp med assay udvikling og kritiske kommentarer til dette manuskript. Dette arbejde blev finansieret af Public Health Agency of Canada og Industrial Research Assistance Program (National Research Council of Canada). Yderligere støtte blev indhentet fra University of Saskatchewan Offentliggørelse fonden.
Materials
| Oligonucleotide name | Company | Sequence1 |
| H279BP | Invitrogen, IDT, or other | Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC |
| H280 | YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT | |
| H1612BP | Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC | |
| H1613 | CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT | |
| 1O, phosphorothioate-C; E, phosphorothioate-G; F, phosphorothioate-A; I, inosine; Y, C or T; R, A or G; K, T or G; S, C or G. | ||
Table 1. Sequences of the modified oligonucleotides for universal cpn60 PCR.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) | Pierce | 22980 | |
| Fluorescent polystyrene beads: MicroPlex Microspheres (Luminex), or Bio-Plex COOH Bead (Bio-Rad) | Luminex or Bio-Rad | Bio-Rad: 171-506xxx where xxx corresponds to the bead identifier | Magnetic beads are becoming available for oligonucleotide coupling and may offer certain advantages. Have not been tried by these authors. |
| Capture oligonucleotides (5′ amino C12 modified) | Invitrogen, IDT, or other | various | Desalted purity level is acceptable. Sequences of the capture probes used to characterize vaginal swabs are provided in the manuscript on which this protocol is based13. |
| T7 exonuclease | New England Biolabs | M0263S | |
| Streptavidin-R-phycoerythrin (SA-PE) | Invitrogen | S-866 | Be careful to obtain high purity SA-PE; this catalog number is recommended |
| Thermowell 96 well PCR plates | Fisher | CS006509 | fit into both 96-well thermocycler and BioPlex machine |
| Thermowell sealing mat | Fisher | CS006555 | Can be re-used; wash with soapy water, rinse well, and dry |
| 5M TMAC | Sigma | T3411 | |
| Bio-Plex or Luminex instrument | Bio-Rad or Luminex | Bio-Rad : 171-000201 | |
| PrimerPlex software for probe design | Premier Biosoft | www.premierbiosoft.com | Suggested for Luminex probe design, although other software platforms may be used |
Table 2. Specific reagents and equipment.
| component | μl/assay | μl/100 assays | final concentration |
| 10x PCR buffer (Invitrogen) | 5 | 500 | 1x |
| 50 mM MgCl2 (Invitrogen) | 2.5 | 250 | 2.5 mM |
| 10 mM dNTP | 1 | 100 | 0.2 mM each |
| H279BP, 25 μM | 0.25 | 25 | 375 nM |
| H1612BP, 25 μM | 0.75 | 75 | 125 nM |
| H280, 25 μM | 0.25 | 25 | 375 nM |
| H1613, 25 μM | 0.75 | 75 | 125 nM |
| Water | 34 | 3400 | — |
| Totals | 44.5 | 4450 |
Table 3. Suggested mixtures for PCR with modified cpn60 UT primers (Table 1). The assay is set up for 5 μl of template DNA and 0.5 μl (2.5U) of Taq DNA polymerase (Invitrogen). Normally large volumes are prepared (e.g. sufficient for 100 assays) and stored at -20°C.
References
- Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. Bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).
- Hay, P. Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot. Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).
- Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. Bacterial vaginosis: a public health review. Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).
- Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women’s susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms. Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).
- Wilson, J. Managing recurrent bacterial vaginosis. Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).
- Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation. J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).
- Ison, C. A., Hay, P. E. Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics. Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).
- Money, D. The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis. Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).
- Schellenberg, J. Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).
- Spear, G. T. Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis. J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).
- Brotman, R. M., Ravel, J. Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis. Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).
- Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).
- Dumonceaux, T. J. Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres. J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).
- Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics. J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).
- Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization. PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).
- Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. cpnDB: A Chaperonin Sequence Database. Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).
- Bradshaw, C. S. The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy. J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).
- Dumonceaux, T. J. Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target. J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).
