Multiplex detectie van bacteriën in complexe klinische en Milieu monsters met behulp van oligonucleotide-coupled Fluorescent Microsferen
Summary
We beschrijven een multiplex methode voor de detectie van micro-organismen in een monster met behulp van oligonucleotide-coupled fluorescerende kralen. Amplicon van alle organismen in een monster is gehybridiseerd met een panel van probe-gekoppelde kralen. Een Luminex of Bio-Plex instrument wordt gebruikt om elke kraal voor kraal type en hybridisatie-signaal zoekopdracht.
Abstract
Bacteriële vaginose (BV) is een terugkerend polymicrobiële syndroom dat wordt gekenmerkt door een verandering in de "normale" microbiota van Lactobacillus gedomineerde naar een microbiota gedomineerd door een aantal bacteriesoorten, zoals Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, en anderen 1-3. Deze voorwaarde wordt in verband gebracht met een reeks van negatieve gevolgen voor de gezondheid, met inbegrip van HIV acquisitie 4, en het kan moeilijk zijn om klinisch 5 beheren. Bovendien heeft de diagnose van BV zich op het gebruik van Gramkleuringen van vaginale uitstrijkje uitstrijkjes die worden gescoord op verschillende numerieke criteria 6,7. Terwijl deze diagnose is eenvoudig, goedkoop, en goed geschikt voor gebieden met beperkte middelen, kan het last hebben van problemen met betrekking tot subjectieve interpretaties en het niet geven een gedetailleerd profiel van de samenstelling van de microbiota vaginale 8. Recente diepe sequencing inspanningen hebben aangetoond een rijke, gevarieerde vaginale microbiota metduidelijke verschillen tussen de monsters genomen van individuen die met BV gediagnosticeerd in vergelijking met de personen die worden beschouwd als normaal 9,10, hetgeen heeft geresulteerd in de identificatie van een aantal potentiële doelwitten voor moleculaire diagnose van BV 11,12. Deze studies hebben een schat aan nuttige informatie, maar diep sequencing is nog niet praktisch als een diagnostische methode in een klinische setting. We hebben onlangs een werkwijze beschreven voor het snel profilering van de vaginale microbiota in een multiplex formaat met behulp van oligonucleotide-gekoppeld fluorescerende kralen met detectie op een Luminex platform 13. Deze methode, als de huidige Gramkleuring-gebaseerde methoden, is snel en eenvoudig, maar voegt het extra voordeel van de exploitatie van moleculaire kennis die voortvloeit uit sequencing studies in probe design. Deze methode geeft daarom een manier om de belangrijkste micro-organismen die aanwezig zijn in een vaginale uitstrijkje dat kan worden gebruikt om de BV diagnose met een hoge specificiteit en sensitiviteit comp profielared om Gramkleuring terwijl aanvullende informatie over de soorten aanwezigheid en overvloed in een semi-kwantitatieve en snelle manier. Deze multiplex methode is uit te breiden tot ver buiten het bereik van de huidige kwantitatieve PCR assays voor bepaalde organismen, die momenteel beperkt tot 5 of 6 verschillende assays in een enkel monster 14. Belangrijk is dat de methode niet beperkt tot de detectie van bacteriën in vaginale swabs en kan eenvoudig aangepast worden om snel het profiel van bijna alle microbiële gemeenschap van belang. Zo hebben we onlangs begonnen met deze methodiek van toepassing zijn op de ontwikkeling van diagnostische tools voor het gebruik in waterzuiveringsinstallaties.
Protocol
Discussion
De specificiteit van het signaal generatie is van cruciaal belang, je moet erop kunnen vertrouwen dat het signaal waargenomen werkelijk weerspiegelt de detectie van amplicon gegenereerd op basis van dat organisme. Software zoals PrimerPlex (Premier Biosoft) kan helpen om probes die efficiënt zal hybridiseren het ontwerp, maar ze kunnen wel of niet cross-hybridiseren niet-doelsoorten. Indien een universele PCR-primers worden gebruikt zoals beschreven in dit protocol, is het belangrijk om in gedachten te houden dat de ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Alberto Severini en Vanessa Goleski voor hulp bij assay ontwikkeling en kritische reacties op dit manuscript. Dit werk werd gefinancierd door de Public Health Agency of Canada en het Industrieel Onderzoeksfonds Assistance Program (National Research Council van Canada). Aanvullende ondersteuning werd verkregen van de Universiteit van Saskatchewan Publicatie Fonds.
Materials
| Oligonucleotide name | Company | Sequence1 |
| H279BP | Invitrogen, IDT, or other | Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC |
| H280 | YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT | |
| H1612BP | Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC | |
| H1613 | CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT | |
| 1O, phosphorothioate-C; E, phosphorothioate-G; F, phosphorothioate-A; I, inosine; Y, C or T; R, A or G; K, T or G; S, C or G. | ||
Table 1. Sequences of the modified oligonucleotides for universal cpn60 PCR.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) | Pierce | 22980 | |
| Fluorescent polystyrene beads: MicroPlex Microspheres (Luminex), or Bio-Plex COOH Bead (Bio-Rad) | Luminex or Bio-Rad | Bio-Rad: 171-506xxx where xxx corresponds to the bead identifier | Magnetic beads are becoming available for oligonucleotide coupling and may offer certain advantages. Have not been tried by these authors. |
| Capture oligonucleotides (5′ amino C12 modified) | Invitrogen, IDT, or other | various | Desalted purity level is acceptable. Sequences of the capture probes used to characterize vaginal swabs are provided in the manuscript on which this protocol is based13. |
| T7 exonuclease | New England Biolabs | M0263S | |
| Streptavidin-R-phycoerythrin (SA-PE) | Invitrogen | S-866 | Be careful to obtain high purity SA-PE; this catalog number is recommended |
| Thermowell 96 well PCR plates | Fisher | CS006509 | fit into both 96-well thermocycler and BioPlex machine |
| Thermowell sealing mat | Fisher | CS006555 | Can be re-used; wash with soapy water, rinse well, and dry |
| 5M TMAC | Sigma | T3411 | |
| Bio-Plex or Luminex instrument | Bio-Rad or Luminex | Bio-Rad : 171-000201 | |
| PrimerPlex software for probe design | Premier Biosoft | www.premierbiosoft.com | Suggested for Luminex probe design, although other software platforms may be used |
Table 2. Specific reagents and equipment.
| component | μl/assay | μl/100 assays | final concentration |
| 10x PCR buffer (Invitrogen) | 5 | 500 | 1x |
| 50 mM MgCl2 (Invitrogen) | 2.5 | 250 | 2.5 mM |
| 10 mM dNTP | 1 | 100 | 0.2 mM each |
| H279BP, 25 μM | 0.25 | 25 | 375 nM |
| H1612BP, 25 μM | 0.75 | 75 | 125 nM |
| H280, 25 μM | 0.25 | 25 | 375 nM |
| H1613, 25 μM | 0.75 | 75 | 125 nM |
| Water | 34 | 3400 | — |
| Totals | 44.5 | 4450 |
Table 3. Suggested mixtures for PCR with modified cpn60 UT primers (Table 1). The assay is set up for 5 μl of template DNA and 0.5 μl (2.5U) of Taq DNA polymerase (Invitrogen). Normally large volumes are prepared (e.g. sufficient for 100 assays) and stored at -20°C.
References
- Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. Bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).
- Hay, P. Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot. Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).
- Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. Bacterial vaginosis: a public health review. Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).
- Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women’s susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms. Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).
- Wilson, J. Managing recurrent bacterial vaginosis. Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).
- Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation. J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).
- Ison, C. A., Hay, P. E. Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics. Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).
- Money, D. The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis. Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).
- Schellenberg, J. Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).
- Spear, G. T. Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis. J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).
- Brotman, R. M., Ravel, J. Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis. Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).
- Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).
- Dumonceaux, T. J. Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres. J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).
- Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics. J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).
- Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization. PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).
- Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. cpnDB: A Chaperonin Sequence Database. Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).
- Bradshaw, C. S. The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy. J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).
- Dumonceaux, T. J. Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target. J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).
