Multiplex detektion av bakterier i komplex klinisk och miljöprover med Oligonucleotide-kopplad fluorescerande mikrosfärer
Summary
Vi beskriver en multiplex metod för detektion av mikroorganismer i ett prov med hjälp oligonukleotid-kopplade fluorescerande pärlor. Amplicon från alla organismer i ett prov är hybridiseras till en panel bestående av sond-kopplade pärlor. En Luminex eller Bio-Plex instrument används för att fråga varje pärla för bead typ och hybridisering signal.
Abstract
Bakteriell vaginos (BV) är ett återkommande polymikrobiella syndrom som kännetecknas av en förändring i den "normala" mikroorganismer från Lactobacillus dominerade till en mikroorganismer som domineras av ett antal bakteriearter, inklusive Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae och andra 1-3. Detta tillstånd är förenat med en rad negativa hälsoeffekter, inklusive hiv förvärv 4, och det kan vara svårt att hantera kliniskt 5. Dessutom har diagnosen BV förlitat sig på användning av Gram fläckar av vaginal provstickan fläckar som är skårade på olika numeriska kriterier 6,7. Även om denna diagnos är enkel, billig och väl lämpad för begränsade resurser inställningar kan man drabbas av problem relaterade till subjektiva tolkningar och det inte ge en detaljerad profil av sammansättningen av vaginala mikroorganismer 8. Nyligen djupa sekvensering ansträngningar har avslöjat ett rikt, mångsidigt vaginal mikrobiota medtydliga skillnader mellan prover från personer som diagnostiseras med BV jämfört med de individer som anses normalt 9,10, vilket har resulterat i att identifiera ett antal potentiella mål för molekylär diagnostik av BV 11,12. Dessa studier har gett en mängd användbar information, men djupt sekvensering är ännu inte praktiskt som en diagnostisk metod i en klinisk miljö. Vi har nyligen beskrivit en metod för att snabbt profilering underlivet mikroorganismer i en multiplex format med oligonukleotid-kopplade fluorescerande pärlor med upptäckt på en Luminex plattform 13. Denna metod, precis som nuvarande gramfärgning-baserade metoder, är snabb och enkel men lägger till ytterligare en fördel att utnyttja molekylära kunskap som sekvensering studier i sond design. Denna metod ger därför ett sätt att profilera de stora mikroorganismer som finns i en vaginal pinnen som kan användas för att diagnostisera BV med hög specificitet och sensitivitet compared att gramfärgning samtidigt som den ger ytterligare information om arter närvaro och överflöd i en semikvantitativ och snabbt sätt. Denna multiplex metod är utbyggbart långt utöver utbudet av nuvarande kvantitativa PCR-analyser för vissa organismer, som för närvarande är begränsad till 5 eller 6 olika tester på ett enda prov 14. Viktigt är metoden inte begränsad till att upptäcka bakterier i slidan kompresser och kan lätt anpassas för att snabbt profilen nästan alla mikrobiella av intresse. Till exempel har vi nyligen börjat tillämpa denna metod för utveckling av diagnostiska verktyg för användning i avloppsreningsverk.
Protocol
Discussion
Specificiteten av signal generation är av avgörande betydelse, du måste vara säker på att signalen observeras verkligen återspeglar upptäckt av amplicon genereras från den skadegöraren. Program som PrimerPlex (Premier Biosoft) kan hjälpa till att utforma sonder som kommer hybridisera effektivt, men de kan eller inte kan över hybridiseras till icke-målarter. När samhällsomfattande PCR används som beskrivs i detta protokoll är det viktigt att hålla i minnet att amplicon genererade representerar alla de or…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Alberto Severini och Vanessa Goleski för hjälp med analys utveckling och kritiska synpunkter på detta manuskript. Detta arbete har finansierats av Public Health Agency of Canada och Industrial Research Assistance Program (National Research Council of Canada). Ytterligare stöd erhölls från University of Saskatchewan Publikation fonden.
Materials
| Oligonucleotide name | Company | Sequence1 |
| H279BP | Invitrogen, IDT, or other | Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC |
| H280 | YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT | |
| H1612BP | Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC | |
| H1613 | CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT | |
| 1O, phosphorothioate-C; E, phosphorothioate-G; F, phosphorothioate-A; I, inosine; Y, C or T; R, A or G; K, T or G; S, C or G. | ||
Table 1. Sequences of the modified oligonucleotides for universal cpn60 PCR.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) | Pierce | 22980 | |
| Fluorescent polystyrene beads: MicroPlex Microspheres (Luminex), or Bio-Plex COOH Bead (Bio-Rad) | Luminex or Bio-Rad | Bio-Rad: 171-506xxx where xxx corresponds to the bead identifier | Magnetic beads are becoming available for oligonucleotide coupling and may offer certain advantages. Have not been tried by these authors. |
| Capture oligonucleotides (5′ amino C12 modified) | Invitrogen, IDT, or other | various | Desalted purity level is acceptable. Sequences of the capture probes used to characterize vaginal swabs are provided in the manuscript on which this protocol is based13. |
| T7 exonuclease | New England Biolabs | M0263S | |
| Streptavidin-R-phycoerythrin (SA-PE) | Invitrogen | S-866 | Be careful to obtain high purity SA-PE; this catalog number is recommended |
| Thermowell 96 well PCR plates | Fisher | CS006509 | fit into both 96-well thermocycler and BioPlex machine |
| Thermowell sealing mat | Fisher | CS006555 | Can be re-used; wash with soapy water, rinse well, and dry |
| 5M TMAC | Sigma | T3411 | |
| Bio-Plex or Luminex instrument | Bio-Rad or Luminex | Bio-Rad : 171-000201 | |
| PrimerPlex software for probe design | Premier Biosoft | www.premierbiosoft.com | Suggested for Luminex probe design, although other software platforms may be used |
Table 2. Specific reagents and equipment.
| component | μl/assay | μl/100 assays | final concentration |
| 10x PCR buffer (Invitrogen) | 5 | 500 | 1x |
| 50 mM MgCl2 (Invitrogen) | 2.5 | 250 | 2.5 mM |
| 10 mM dNTP | 1 | 100 | 0.2 mM each |
| H279BP, 25 μM | 0.25 | 25 | 375 nM |
| H1612BP, 25 μM | 0.75 | 75 | 125 nM |
| H280, 25 μM | 0.25 | 25 | 375 nM |
| H1613, 25 μM | 0.75 | 75 | 125 nM |
| Water | 34 | 3400 | — |
| Totals | 44.5 | 4450 |
Table 3. Suggested mixtures for PCR with modified cpn60 UT primers (Table 1). The assay is set up for 5 μl of template DNA and 0.5 μl (2.5U) of Taq DNA polymerase (Invitrogen). Normally large volumes are prepared (e.g. sufficient for 100 assays) and stored at -20°C.
References
- Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. Bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).
- Hay, P. Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot. Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).
- Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. Bacterial vaginosis: a public health review. Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).
- Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women’s susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms. Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).
- Wilson, J. Managing recurrent bacterial vaginosis. Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).
- Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation. J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).
- Ison, C. A., Hay, P. E. Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics. Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).
- Money, D. The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis. Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).
- Schellenberg, J. Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).
- Spear, G. T. Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis. J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).
- Brotman, R. M., Ravel, J. Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis. Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).
- Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).
- Dumonceaux, T. J. Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres. J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).
- Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics. J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).
- Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization. PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).
- Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. cpnDB: A Chaperonin Sequence Database. Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).
- Bradshaw, C. S. The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy. J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).
- Dumonceaux, T. J. Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target. J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).
