Parasitoid (기생) 말벌을 포함한 여러 곤충들의 천적의 주요 클래스를 구성 Drosophila melanogaster. 우리는 이러한 기생충을 전파하는 기법을 소개합니다 Drosophila SPP. 과 면역 조직에 미치는 영향을 분석하는 방법을 보여줍니다 Drosophila 애벌레.
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이 논문에서
요약
초록
알려진 대부분의 기생벌 종은 Drosophila의 유충 또는 번데기 단계를 공격합니다. Trichopria drosophilae는 숙주의 번데기 단계를 감염시키지만(Fig. 1A-C), Leptopilina 속(Fig. 1D, 1F, 1G)과 Ganaspis 속(Fig. 1E)의 암컷은 유충 단계를 공격합니다. 우리는 이러한 기생충들을 사용하여 생물학적 군비 경쟁의 분자적 기초를 연구합니다. 기생벌은 생물학적 제어제로서 엄청난 가치를 지닙니다. 이들 대부분은 숙주의 생리와 면역을 변화시키는 독성 인자 및 기타 요인들을 보유하고 있습니다. Drosophila 기생벌에 대한 분석은 종 특이적 상호작용이 자연 군집의 유전적 구조를 어떻게 형성하는지에 대한 통찰을 제공합니다. 또한 이러한 연구들은 숙주의 면역 생리와 이러한 분류군의 기생충에 의해 조정된 면역 반응이 어떻게 저지되는지를 이해하기 위한 모델 역할을 합니다.
유충 및 번데기의 큐티클은 1차 방어선 역할을 합니다. 말벌의 산란관은 날카로운 바늘 모양의 구조로, 숙주의 혈강 내로 알을 효율적으로 전달합니다. 산란 후에는 큐티클 부위에서 상처 치유 반응이 일어납니다(Fig. 1C, 화살표 머리). 일부 말벌은 동일한 숙주에 두 개 이상의 알을 삽입할 수 있지만, 단 하나의 알만 부화에 성공합니다. 과잉 산란된 알이나 발달 중인 유충은 아직 밝혀지지 않은 과정에 의해 제거됩니다. 따라서 이러한 말벌들을 단독 기생벌이라고 합니다.
초파리 계통과 말벌 종에 따라 말벌 알은 두 가지 운명 중 하나를 맞이합니다. 알이 캡슐화되어 발달이 차단되거나(숙주 부화; Fig. 2 왼쪽), 또는 말벌 알이 부화하여 발달, 탈피를 거쳐 성체로 성장합니다(말벌 부화; Fig. 2 오른쪽). L. heterotoma는 Drosophila 기생 말벌 중 가장 잘 연구된 종 중 하나입니다. 이 종은 "일반주의자(generalist)"로, 대부분의 Drosophila 종을 숙주로 이용할 수 있음을 의미합니다1. L. heterotoma와 L. victoriae는 자매 종이며, 이들은 캡슐화 반응을 능동적으로 방해하는 바이러스 유사 입자를 생성합니다2. L. heterotoma와 달리 L. boulardi는 전문 기생충(specialist parasite)이며, 이용하는 Drosophila 종의 범위가 상대적으로 제한적입니다1. L. boulardi 계통 또한 바이러스 유사 입자를 생성하지만3, D. melanogaster에서 성공하는 능력에는 상당한 차이가 있습니다1. 일부 L. boulardi 계통의 경우 초파리 숙주가 알을 캡슐화하는 데 자주 성공하기 때문에 D. melanogaster에서 배양하기가 어렵습니다1. 따라서 특정 실험 프로토콜에서는 두 파트너 모두에 대한 지식을 갖추는 것이 중요합니다.
장벽 조직(큐티클, 장 및 기관) 외에도, Drosophila 유충은 각각 혈구와 지방체(fat body)의 기능에서 기인하는 전신적 세포 및 체액성 면역 반응을 가지고 있습니다. L. boulardi의 산란은 이 두 가지 면역 체계를 모두 활성화합니다1,4. 혈구는 순환계, 분절된 큐티클 아래의 고정된 집단, 그리고 림프샘에서 발견됩니다. 림프샘은 유충의 등쪽에 위치한 작은 조혈 기관입니다. 로브(lobe)라고 불리는 조혈 세포 집단이 동물의 전후 축을 따라 뻗어 있는 등쪽 혈관을 따라 분절적으로 쌍을 이루어 배열되어 있습니다(그림 3A). 지방체는 커다란 다기능 기관입니다(그림 3B). 이는 미생물 및 후생동물 감염에 반응하여 항균 펩타이드를 분비합니다.
말벌 감염은 면역 신호 전달을 활성화합니다 (그림 4)4. 세포 수준에서 이는 혈구의 분열과 분화를 유발합니다. 자기방어 기전으로, 감염된 동물의 혈강 내에서는 응집체와 캡슐이 형성됩니다 (그림 5)5,6. 활성화된 혈구들은 말벌 알(또는 말벌 유충) 쪽으로 이동하여 그 주변에 캡슐을 형성하기 시작합니다 (그림 5A-F). 일부 혈구들은 응집되어 결절을 형성합니다 (그림 5G-H). 세밀한 분석 결과, 말벌 감염이 가장 앞쪽에 위치한 림프샘 엽의 주변부 분산을 유도한다는 것이 밝혀졌습니다 (그림 6C, D).
말벌 감염 후 림프샘과 혈강에서 발생하는 특이적 변화를 어떻게 연구할 수 있는지 설명하기 위해, Toll 신호 전달 경로 구성 요소인 Dorsal 및 Spätzle(그림 4,5,7)와 그 표적인 Drosomycin(그림 6)의 대표 데이터를 제시합니다. 여기에 설명된 해부 프로토콜을 통해 숙주 혈림프에서 말벌 알(또는 발달 단계의 말벌)을 얻을 수도 있습니다(그림 8).
프로토콜
실험에 대한 전체 프로토콜은 네 단계 (그림 9)으로 나누어져 있습니다. 파리 유충에 (1) Culturing의 말벌 (2) 감염을 설정 및 해부를 위해 동물을 준비 (3) 분리 및 호스트 / 기생충 구조를 고치고, (4) 면역 조직 분석.
1. Drosophila의 애벌레에 Culturing의 말벌
말벌 문화의 유지 보수 신중한 계획이 필요합니다. 성장하는 파리에 대한 상대, 그것은 상당히 노동 집중이다. 우리는 24 ° C.에 Drosophila의 yw 변형의 유충이나 pupae의 실험실에있는 말벌의 식민지를 유지 Culturing의 말벌은 올바른 단계에서 호스트의 지속적인 소스를 유지 말벌보다 먼저 등장 파리의 "감염된"튜브를 청소하는 것입니다. 말벌은 성 결정 haplodiploid 방법을 따라하고 그들이 호스트를 감염하기 전에 여성이 성관계를하는 것이 중요합니다.
- 제 1 일에서 갓 미리의 작은 소량을 추가앞에 서 효모 붙여넣기 (신선한 플라이 식품 유리병에 활성 건조 효모의 약 1g에 물 1 ML을 혼합하여 만든 플라이 음식의 조리법은 중요하지 않으며. 우리 corn-meal/sucrose/agar....
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토론
Drosophila의 기생 말벌에 대한 관심은 전체 genomes를 해독하기위한 분자 기술은 효율적이고 비용 효과가로 서징있다. 그러나 그들의 매우 잘 공부 호스트에 상대적으로, 말벌 생물학의 많은 매혹적인 측면이 모호한 상태로 유지됩니다. 이러한 범위, 면역 억제, superparasitism, 그리고 행동을 호스팅과 관련된 문제가 포함됩니다. 이 프레 젠 테이션의 초점은 파리의 면역 조직에서 감염의 효과를 입증하는 것이었다. 여기를 시연 해부 기술은 RNA 레벨 (원위치 하이브리드화의 경우)이나 microarrays이나 PCR, 또는 단백질의 서양 분석을위한 핵산의 추출을위한 유전자 발현의 분석에 사용될 수 있습니다. 플라이 종자의 광대한 다양한 주식 센터와 면역 세포를 조작 및 레이블 개별 연구 실험실에서 사용할 수 있습니다. 플라이 종자의 선택은 실험적인 질문에 의해 결정됩니다. 이러한 해부 기술은 또한 면역의 분석에 사용될 수 있습니다다른 Drosophila 수종의 조직.......
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공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
우리는 Trichopria drosophilae, 유전자 변형 뜬 종자를위한 교수 토니의 IP, 그리고 안티 Spätzle 항체에 대해 교수 칼 하시 모토위한 교수 토드 Schlenke에 감사를드립니다. 이 프레 젠 테이션에 대한 그들의 공헌에 대한 연구소의 현재와 과거 회원을 감사드립니다. NIH (S06 GM08168, 대두 41399-009, 그리고 G12-RR03060), USDA (NRI / USDA CSREES 2006-03817하고 2009-35302-05277) 및 PSC-CUNY에서이 작품은 다음과 같은 보조금에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 자료 | 유형 | 회사 | 카탈로그 번호 |
| 곤충의 문화 유지를위한 자료 | |||
| 누룩 | 활성 건조 | 피셔 과학 | S802453 |
| 음식 들아 | 옥수수 식사, 설탕 | 표준 제조법 | |
| 꿀 | 클로버 | 네덜란드 골드 | |
| 튜브 | 폴리 프로필렌 셸 튜브 (좁은) | 피셔 과학 | AS514 |
| 유리병에 폐쇄 | 코튼 플러그 | 피셔 과학 | AS212 |
| 유리병에 폐쇄 | 버즈 플러그 | Genesee 과학 | AS273 |
| 냉장 인큐베이터 | 정밀 815 | 써모 과학 | 3721 |
| 샘플 준비를위한 자료 | |||
| CO 2 탱크 | 뼈 건조 학년 | TW 스미스 | UN1013 |
| 주걱 | 마이크로 주걱 (14 ㎝) | 피셔 과학 | 21-401-15 |
| Pyrex 명소 테스트 플레이트 | 9 - 잘 해부 판 85mm X 100mm | 토마스 과학 | 7812G17 |
| 파스퇴르 Pipettes | 소다 석회 | J & H Berge | 71-5200-05 |
| 집게 | 스타일 # 5 | 시그마 | T-4662 |
| 에탄올 | 190 증거의 USP | 피셔 과학 | 04-355-221 |
| 포름 알데히드 | 37% W / w | 피셔 과학 | F79-1 |
| 이차 항체 Cy3 AffiniPure 당나귀 안티 토끼 IgG (H + L) | 1시 50분 여진 546 nm의; 배출 565 nm의 | 잭슨 Immuno 리서치 연구소 주식 회사 | 711-165-152 |
| Antifade (N-프로필 gallate) | 1X PBS에 50 % 글리세롤 4 μg / ML | MP의 Biomedicals | 10274790 |
| 글리세린 | 피셔 과학 | G33-1 | |
| Hoechst 33258 | 0.2 μg / ML 여기 352 nm의; 배출 461 nm의 | 분자 프로브 | H-1398 |
| Rhodamine phalloidin | 200 개가 / ML (6.6μm의) 여진 540 nm의; 배출 565 nm의 | 분자 프로브 | R415 |
| 알렉사 형석 488 phalloidin | 300 단위 / ML 여기 495 nm의; 배출 518 nm의 | 분자 프로브 | A12379 |
| Disposables | |||
| 병을 씻으십시오 | Fisherbrand | 피셔 과학 | 03-409-22A |
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| 자이스 혈구 레이저 공촛점 현미경 스캐닝 | LSM 510 | 칼 자이스 혈구 | |
| 자이스 혈구 복합 현미경 | 직립 Axioplan이 | 칼 자이스 혈구 |
| 말벌의 변종 | 스트레인 날기의 |
|---|---|
| Leptopilina victoriae 16 | yw |
| Leptopilina boulardi 17 1 | UAS-GFP-지느러미 17 |
| Leptopilina heterotoma이 | SerpentHemoGal4 13 |
| Leptopilina heterotoma 14 1 | MSNF9-moCherry 14 |
| Trichopria drosophilae | MSNF-GFP 15 |
| Ganaspis xanthopoda 18 | yw 뱀의-Gal4 UAS GFP-Dorsal/Basc 4 |
| yw; Drosomycin-GFP/CyO Y + 12 |
참고문헌
- Schlenke, T. A., Morales, J., Govind, S., Clark, A. G. Contrasting infection strategies in generalist and specialist wasp parasitoids of Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3, 1486-1501 (2007).
- Chiu, H., Morales, J., Govind, S.
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