Vi beskriver en metod att föremål anhängare celler att laminärt flöde skjuvspänning i en steril kontinuerligt flöde krets. Cellernas vidhäftning kan morfologi studeras genom de genomskinliga kammaren, prover från kretsen för metabolit analys och celler skördas efter skjuvning exponering för framtida experiment eller kultur.
Det övergripande målet med denna metod är att beskriva en teknik för att föremål anhängare celler villkor laminärt flöde och utvärdera deras svar på såväl kvantifierbara vätska skjuvspänningar 1.
Vår flöde kammare design och flöde krets (Fig. 1) innehåller ett transparent visning region som möjliggör testning av cell adhesion och avbildning av cellmorfologin omedelbart före flöde (Fig. 11A, B), vid olika tidpunkter under flöde (Fig. 11C) och efter flöde (Fig. 11D). Dessa experiment illustreras med humant navelsträngsblod som härrör från endotelceller progenitorceller (EPC) och svin EPC 2,3.
Denna metod är också tillämplig på andra anhängare celltyper, t.ex. glatta muskelceller (SMC) eller fibroblaster.
Kammaren och alla delar av kretsen är lätt steriliseras med ånga autoklavering. I motsats till andrakammare, kan t.ex. mikroflödessystem kammare, ett stort antal celler (> 1 miljon beroende på cellstorlek) skall krävas in efter flödet experiment under sterila förhållanden för cellodling eller andra experiment, till exempel DNA eller RNA-extraktion, eller immunohistokemi (Fig. 11e), eller svepelektronmikroskop 5. Den skjuvspänningen kan justeras genom att variera flödet i perfusionsvätskan, vätskan viskositet, eller kanalen höjd och bredd. Det senare kan minska vätskevolym eller behöver cellen samtidigt som endimensionella flöden bibehålls. Det är inte nödvändigt att mäta kammare höjd mellan experiment, eftersom kammaren höjden inte beror på användningen av packningar, vilket kraftigt ökar lätthet av flera experiment. Dessutom möjliggör kretsdesign lätt insamling av perfusatet prover för analys och / eller kvantifiering av metaboliter utsöndras av celler i vätskan skjuvspänning exponering, t.ex. kväveoxid (Fig. 12) 6 </sup>.
Vår flöde krets och flöde kammare tillåter oss att ämnet anhängare celler, t.ex. EPC, för att definieras betonar vätska skjuvning. Eftersom kammaren topp och botten är transparenta, cell adhesion och morfologi kan utvärderas antingen i realtid, genom kammaren själv, eller efter ett flöde experiment och demontering av flödet kammaren. Vid den tidpunkten, kan cellerna skördas under sterila förhållanden och antingen åter pläterade, eller användas för att samla in deras DNA eller RNA, etc., för vidare analys.
För att uppnå laminärt flöde måste utformningen av kammarens vara sådant att flera villkor är uppfyllda.
Först måste flödet vara laminärt, som kan kontrolleras genom att beräkna Reynolds tal (Re), vilket är förhållandet mellan tröghetskrafter till viskösa krafter. (Om viskösa krafter dominerar, är Re liten och flödet är laminärt eller "fullt utvecklad" – vanligtvis för Re <2300.Om tröghetskrafter dominerar, blir flödet mer och mer slumpmässiga tills den är turbulent, vilket är fallet för Re> 4000.) Vi kan beräkna Re enligt ekvation 3 8,
Där ρ är den vätska densitet, Q flödet, är μ viskositeten, B och H är bredden och höjden av kammaren, respektive, och D h är den hydrauliska diametern, definierad enligt ekvation 4 8,
Reynolds tal av våra tre flöde kammare, med höjder mellan 166 till 267 ìm, intervall 13,9 till 34,6 vid flöden Calculated att få en skjuvspänning på 15 dynes / cm 2. Vid flöden beräknas för en skjuvspänning på 100 dynes / cm 2, varierade Reynolds tal av kamrarna 90,4 till 234. Alla dessa Reynoldstal är mycket lägre än 2300 och uppfyller kriteriet för laminärt flöde.
För det andra att för hastighetsfältet och skjuvspänning vara oberoende av avståndet längs flödet kanal (dvs fullt utvecklad), avståndet från vätskan inloppet till bilden måste vara längre än entrén längd, L e. Detta kan tillgodoses genom att beräkna entrén längden, enligt ekvation 5 9.
För de värden som anges ovan, varierar ingången längd 0,01 till 0,25 cm.
Tredje, för att säkerställa att hastighet och skjuvspänning i sidled inte varierarväsentligt från värdet för endimensionella kanal flöde (Δ Ph / 2L), måste förhållandet H / W vara mycket mindre än 1. För den genomsnittliga väggen skjuvspänningen under två-dimensionell flöde till 95% av väggen skjuvspänningen i endimensionella flöde måste H / B vara lika med 0,10, och för väggen skjuvspänningen under två-dimensionell flöde villkor som ska 97,5% av väggen skjuvspänningen i endimensionella flöde måste H / B vara lika med 0,05. Med dimensionerna av våra utformade flöde kammare 1,7 cm på bredden och 166 till 267 mikrometer i höjd, är dessa kriterier uppfyllda.
Trycket kommer att variera endast i flödesriktningen om det inte finns sidled tryckgradienter vid entrén. Detta kan bedömas med hjälp av färgämnen eller partiklar i flödet väg. Vidare, för jämnt flöde experiment, är en Pulsdämpare in i flödet kretsen. Den Pulsdämpare tar ut större delen av pulsatility orsakas av rullen pumpen i kretsen, och tillåter oss att närma antagandet om jämn ström. Notera bör Pulsdämpare används vara förenligt med pump och slangar som används i kretsen, så att det effektivt kan eliminera svängningar i produktionen flöde för den specifika frekvenser av rullen pumpen. I vår demonstration den Masterflex L / S Pulsdämpare uppnår laminärt flöde när det används om ansvarsfrihet linje med eventuella Masterflex L / S-serien pumpen (0 till 600 RPM) och I / P 26 slangar. För pulserande flöde, kan en programmerbar pump användas för att generera olika vågformer.
För pulserande flöde, kan en programmerbar pump användas för att generera olika vågformer.
Dessutom är kretsen utformat så att prov perfusatet kan enkelt samlas in vid olika tidpunkter utan att riskera förorening av celler eller flöde medium. I vårt exempel koncentrationen av NO 2 – mättes genom kemiluminiscens meden Ionics / Sievers kväveoxid Analyzer (NOA 280, Sievers Instrument, Boulder, CO) som tidigare beskrivits 10. De reduktionsmedel som används för nitrit analys kaliumjodid i ättiksyra (14,5 M ättiksyra och 0,05 M KI), som har potential att minska för att konvertera nitrit till NO, men är otillräcklig för att minska eventuella högre kväveoxider som nitrat och därmed är relativt specifikt för nitrit. Den totala mängden nitrit producerad beräknades som produkten av producerade koncentration och den totala volymen av banan medan du justerar för volym förlorad när provtagning 6.
Följande steg är avgörande för ett framgångsrikt genomförande av flödet experiment:
En eventuell begränsning av vårt flöde kammare är att höjden fastställs av höjden på kanalen frästa i aluminium. Detta har dock fördelen att inte behöva kontrollera och justera höjden på kanalen före varje experiment och därför förenklar skjuvspänningen beräkningar bara att justera flödet till önskat värde. Beroende på din forskning mål, kan det vara önskvärt attöka skjuvspänningen utan att öka varvtalet. I detta fall rekommenderar vi att öka perfusatet viskositet, t.ex. lägga dextran till mediet 11.
En eventuell begränsning av flödet kretsen är den stora mängden medium som används, vilket kan innebära problem när man försöker kvantifiera mycket små koncentrationer av cell metaboliter. Även om det inte visas här, är det möjligt att avsevärt minska kretsen volymen med hjälp av en mindre reservoar och Pulsdämpare och minska slang längd och diameter.
Dessutom finns det flera andra kommersiellt tillgängliga system som kan användas för att tillämpa vätska skjuvspänning till celler i kultur. Mikroflödessystem-baserade system, t.ex. BioFlux systemet från Fluxion, möjliggör samtidig analys av celler i olika mikroflödessystem flödet kanaler laddat med lösningen i brunnar fungerar som input och reservoarer utgång för dessa kanaler 12,13,14. Men dessa och andra mikroorganismerfluidic system är inte kompatibla med standard objektglas och inte möjliggör återvinning av ett tillräckligt stort antal celler för ytterligare experiment, såsom RT-PCR eller Western blot. Dessutom är de mindre användarvänligt, kostar minst $ 40.000 och kan nå en totalt mer än $ 100.000, beroende på tillbehör utrustning.
Två macrofluidic system som finns från Flexcell International Corporation, Flexcell Streamer och system FlexFlow, har framgångsrikt använts för att studera endotelceller 15,16,17, mänskliga annulus celler 18 och fibroblaster 19 i vätska flöde. Ett tredje system, tillgängligt via GlycoTech, har använts för att studera tumörens celladhesion 20 och leukocyt vidhäftning 21 till endothelial monolager.
Streamer systemet tillåter flera diabilder som ska köras under samma skjuvspänningen villkor på en gång, men saknar ett fönster och – till skillnad från våraDesign – inte medger realtid visualisering av celler under flödet.
Det FlexFlow Systemet har ett visningsfönster, men kräver en upprätt mikroskop, vilket kanske inte är det vanliga mikroskop används i de flesta laboratorier. Vidare kräver FlexFlow systemet en cell-belagd täckglas att vändas när den placeras i flödet kammaren. Detta utesluter visualisering av fluorescerande celler på en ogenomskinlig yta, som titan-belagt glas, som vi visar i vår studie. Slutligen, den specialiserade täckglas måste köpas särskilt för FlexFlow systemet, som i flera tusen dollar prisklass, liknande det Flexcell Streamer systemet.
GlycoTech erbjuder cirkulära och rektangulära parallell-platta flöde kammare, som är betydligt billigare, men tillverkas av gjuten akryl som inte lämpligen kan bero autoklaveras som vår kammare. Notera att andra flödet kamrar som har beskrivits vara autoklaverbaraförefaller opraktiskt eftersom de kräver speciella mikroskopiska linser 22,23. Det GlycoTech systemet använder kisel gummipackningar inföll mellan topp och botten plattor, vilket kommer att förändras i tjocklek med upprepad användning och därför förändras kammare höjd över tid (tillverkaren rekommenderar köp av nya efter var tionde använder). Vår aluminium kammare med inbyggd O-ringar tillåter komplett motstånd från topp och botten plattor och säkerställer konstant kammare höjd mellan experiment. Slutligen vakuumpumpar är nödvändiga för att uppnå en tät försegling i många utföranden flödet rum, inklusive GlycoTech kamrar, som inte är nödvändiga i vår design.
De som inte visas här, kan flödet kammaren hållas under ett mikroskop under hela flödet experimentet i realtid avbildning av cell adhesion och / eller beteende. Om detta önskas, rekommenderar vi att du använder värmelampa eller en uppvärmd platta i kammaren att hålla perfusatet temperaturen vid 37 ° C. Furdär kan rullen pumpen ersättas med en sprutpump, om ingen "recirkulation" av antingen celler eller metaboliter eller läkemedelssubstanser eller agenter önskas 24.
Det är också möjligt att flöda annorlunda märkta celler över anhängare celler, t.ex. fluorescerande trombocyter under ett lager av konfluenta EPC (med hjälp av trombocyter analys beskrivs av Achneck et al. 6,25) för att utvärdera cell till cell interaktion i vätska skjuvspänning. Vår flöde kammare kombinerar värdefulla funktioner av andra tillgängliga flöde kammare, såsom en perfusat provtagning port och ett fönster och har den viktiga fördelen av kompatibilitet med antingen en inverterad eller upprätt mikroskop. Det är helt autoklaverbara och tillåter upprepade försök vid konstant kammare höjd och utan behov av vakuumpumpar för att uppnå en tät försegling.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Joe Owen inom det biomedicinska instrument och Machine Shop för hans outtröttliga insatser i bearbetning och montering av delar flödet kammaren och Matt Maudsley från Leica Microsystems för att hjälpa i tekniker för att bilden celler genom flöde kammare. Vi står i tacksamhetsskuld till Kevin Collins från Duke Perfusion Services och Dr Steve Wallace vid Institutionen för medicinsk teknik för bra förslag på flödet kretskonstruktion. Vi vill också tacka National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program för att stödja Alexandra Jantzen och NIH för deras stöd genom Grant "Autolog EPC foder för att förbättra biokompatibilitet av cirkulationsrubbningar hjälpa enheter" RC1HL099863-01.
Products / Reagents | Company | Product # |
10 ml Syringe | Cole Parmer Instrument Co. | 07940-12 |
1-Way Stopcoks | Cole Parmer Instrument Co. | 30600-00 |
30 ml Syringe | BD Medical | 309650 |
4 -Way Stopcocks | Cole Parmer Instrument Co. | 30600-04 |
Aluminum Alloy | N/A | 6061 |
Cell-Culture Dishes (4-well, rectangular) | Thermo Scientific; Nunc | 267061 |
Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 |
DMSO | Research Organics | 2162D |
DPBS (-/-) | Invitrogen | 14190-144 |
EGM-2 Singlequots | Lonza | CC-4176 |
Female Luer Adaptor | Cole Parmer Instrument Co. | SI-45500-04 |
Fibronectin | Sigma | F0895-2MG |
Glass Bottle (250ml) with Cap | Cole Parmer Instrument Co. | 34594-24 |
Hard Tubing | Cole Parmer Instrument Co. | 06508-16 |
HBSS | Sigma | H8264-500ML |
Histopaque | Sigma | H8889-500ML |
Hoechst Stain Solution | Sigma | H6024 |
Hyclone FBS | Thermo Scientific | SH30071.01 |
L-glutamine | Lonza | 17-605E |
Male Luer Adaptor | Cole Parmer Instrument Co. | EW-45505-04 |
MCDB-131, 1X Medium | Cellgro | 15-100-CV |
Barbed Polypropylene Fittings | Cole Parmer Instrument Co. | 06365-90 |
O-Rings | N/A | AS568A |
Pulse-Dampener | Cole Parmer Instrument Co. | 07596-20 |
Pump-Drive (Masterflex L/S variable-speed economy drive) | Cole Parmer Instrument Co. | 7524-40 |
Pump-Head (Masterflex Easy Load Pump Head) | Cole Parmer Instrument Co. | 07518-60 |
Slide | Cole Parmer Instrument Co. | 48500-00 |
Soft Tubing | Cole Parmer Instrument Co. | 96400-16 |
Syringe filter | Cole Parmer Instrument Co. | 02915-12 |
Sytox Orange Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11368 |
Trypsin EDTA | Lonza | CC-5012 |
Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 |