Roterende Cell Kultur Systems for Human Cell Culture: Human trophoblast Cells som en modell
Summary
Tradisjonell, todimensjonale cellekultur teknikker ofte resultere i endrede egenskaper med hensyn til differensiering markører, cytokiner og vekstfaktorer. Tredimensjonal cellekultur i den roterende cellekultur system (RCCS) gjenoppretter uttrykk for mange av disse faktorene som vist her med en extravillous trophoblast cellelinje.
Abstract
Feltet av menneskelige trophoblast forskning hjelpemidler i å forstå det komplekse miljøet etablert i løpet placentation. På grunn av disse studiene, er menneskelig in vivo eksperimentering umulig. En kombinasjon av primær kulturer, eksplantering kulturer og trophoblast cellelinjer som en støtte for vår forståelse av invasjonen av livmorveggen 2 og ombygging av livmor spiral arterier 3,4 av extravillous trophoblast celler (EVTs), som er nødvendig for en vellykket etablering av svangerskapet. Til tross for vell av kunnskap gleaned fra slike modeller, er det akseptert at in vitro cellekultur modeller ved hjelp av EVT-lignende cellelinjene vise endres cellular egenskaper når sammenlignet med sine in vivo kolleger 5,6. Celler dyrket i den roterende cellekultur system (RCCS) display morfologiske, fenotypisk og funksjonelle egenskaper EVT-lignende cellelinjene som nærmere etterligner differensiere i uTero EVTs, med økt uttrykk av gener mediere invasjon (f.eks matrix metalloproteinaser (MMPs)) og trophoblast differensiering 7,8,9. Saint Georges Hospital placenta celle Line-4 (SGHPL-4) (vennlig donert av Dr. Guy Whitley og dr. Judith Cartwright) er en EVT-lignende cellelinje som ble brukt for testing i RCCS.
Utformingen av RCCS kultur fartøyet er basert på prinsippet om at organer og vev fungerer i en tredimensjonal (3D) miljø. På grunn av den dynamiske kulturen forholdene i fartøyet, herunder vilkår for fysiologisk relevante skjær, celler dyrket i tre dimensjoner skjemaet tilslag basert på naturlige cellulære tilhørighet og differensieres til organotypic vev-liknende forsamlinger 10,11,12. Opprettholdelsen av et fluid bane gir en lav skjæring, lav turbulens miljø som ligner forholdene funnet in vivo. Sedimentasjon av dyrkede celler er motvirkes ved å justere rotasjonenHastigheten på RCCS å sikre en konstant fritt fall av celler. Gassutveksling skjer gjennom en permeabel hydrofob membran plassert på baksiden av bioreaktor. Som sine foreldre vev in vivo, RCCS dyrket cellene er i stand til å svare på kjemisk og molekylær gradienter i tre dimensjoner (dvs på sin apikale, basal og sideflatene) fordi de er dyrket på overflaten av porøse microcarrier perler. Når vokst som to-dimensjonale monolayers på tette flater som plast, er celler fratatt denne viktige kommunikasjonen på sitt basal overflaten. Følgelig, den romlige begrensninger pålagt av miljøet dypt påvirke hvordan cellene fornuft og dekode signalene fra omkringliggende mikromiljøet, og dermed innebærer en viktig rolle for 3-D miljø 13.
Vi har brukt RCCS til ingeniør biologisk meningsfylt 3-D modeller av ulike menneskelige epitelvev 7,14,15,16. Faktisk, mange tidligere rapporter har DEMonstrated at celler dyrket i RCCS kan anta fysiologisk relevante fenotyper som ikke har vært mulig med andre modeller 10,17-21. I sammendraget, representerer kulturen i RCCS en enkel, reproduserbar, high-throughput plattform som gir et stort antall differensierte celler som er mottagelig for en rekke eksperimentelle manipulasjoner. I det følgende protokoll, bruke EVTs som et eksempel, vi tydelig beskriver trinnene som kreves for å tredimensjonalt kultur tilhenger celler i RCCS.
Protocol
Discussion
Kulturen teknikken som presenteres her gir etterforskere med svært invasiv EVT-lignende celler. Det har nå blitt anerkjent som et tap av differensiering skjer i monolayers grunn av hemming av cellulære responser på kjemiske og molekylære signaler i tre dimensjoner (apikale, basal og lateral celleoverflaten) 10,13. Denne teknikken reflekterer kjennetegn bemerket i utero på invaderende EVT celler. Som prosedyren etterligner konvensjonelle monolayer vev kultur tid kinetikk, men gir celler med diff…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av det amerikanske National Institutes of Health stipend NIH / NICHD # HD051998 (til CAM).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Cytodex microcarrier beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| Rotating Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units |
| RCCS Disposable Units | Synthecon | Contact Synthecon | |
| 3ml Luer-Lock tip syringe | BD | 309585 | |
| 10ml wide-tip serological pipette | BD | 357504 | |
| MEM Alpha | Invitrogen | 12561-072 | |
| Leibovitz’s L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-039 | |
| H2O, Endotoxin free | Fisher | MT-25-055-CM | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-7795 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-100 | |
| Fructose | Sigma-Aldrich | F3510-100 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G5388-100 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| FBS | Invitrogen | 10437 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
References
- Knofler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. Int. J. Dev. Biol. 54, 269-269 (2010).
- Cartwright, J. E. Remodelling at the maternal-fetal interface: relevance to human pregnancy disorders. Reproduction. 140, 803-803 (2010).
- Harris, L. K. IFPA Gabor Than Award lecture: Transformation of the spiral arteries in human pregnancy: key events in the remodelling timeline. Placenta. 32, S154-S154 (2011).
- Whitley, G. S., Cartwright, J. E. Trophoblast-mediated spiral artery remodelling: a role for apoptosis. J. Anat. 215, 21-21 (2009).
- Apps, R. Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells. Placenta. 32, 33-33 (2011).
- Bilban, M. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31, 989-989 (2010).
- LaMarca, H. L. Three-dimensional growth of extravillous cytotrophoblasts promotes differentiation and invasion. Placenta. 26, 709-709 (2005).
- Jovanovic, M., Stefanoska, I., Radojcic, L., Vicovac, L. Interleukin-8 (CXCL8) stimulates trophoblast cell migration and invasion by increasing levels of matrix metalloproteinase (MMP)2 and MMP9 and integrins alpha5 and beta1. Reproduction. 139, 789-789 (2010).
- Husslein, H. Expression, regulation and functional characterization of matrix metalloproteinase-3 of human trophoblast. Placenta. 30, 284-284 (2009).
- Barrila, J. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat. Rev. Microbiol. 8, 791-791 (2010).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 281, 12-12 (2001).
- Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat. Med. 4, 901-901 (1998).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J. Cell. Sci. 116, 2377-2377 (2003).
- Bentrup, H. ?. ?. n. e. r. z. u., K, . Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes. Infect. 8, 1813-1813 (2006).
- Carterson, A. J. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect. Immun. 73, 1129-1129 (2005).
- Myers, T. A. Closing the phenotypic gap between transformed neuronal cell lines in culture and untransformed neurons. J. Neurosci. Methods. 174, 31-31 (2008).
- Hjelm, B. E. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-617 (2010).
- Straub, T. M. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg. Infect. Dis. 13, 396-396 (2007).
- Nickerson, C. A. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect. Immun. 69, 7106-7106 (2001).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O’Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell. Microbiol. 7, 1771-1771 (2005).
- Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol. J. 6, 103-103 (2009).
- Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
- Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
- GE Healthcare. Microcarrier Cell Culture – Principles and Methods. Handbooks. , (2005).
