High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten Met behulp van de lipidische Bicelle Method
Summary
Bicelles zijn lipide / amfifiele mengsels die membraaneiwitten (MP's) te behouden binnen een lipide bilaag, maar hebben een unieke fase gedrag dat high-throughput screening vergemakkelijkt door kristallisatie robots. Deze techniek heeft met succes geproduceerd een aantal hoge resolutie structuren van zowel prokaryotische en eukaryotische bronnen. Deze video beschrijft protocollen voor het genereren van de lipidische bicelle mengsel, waarin parlementsleden in de bicelle mengsel, het opzetten van kristallisaties trials (zowel handmatig als robot) en het oogsten van kristallen van het medium.
Abstract
Membraaneiwitten (MP's) spelen een cruciale rol in vele fysiologische processen, zoals het verpompen van specifieke moleculen door de anders ondoordringbare membraan bilaag dat alle cellen en organellen omringt. Wijzigingen in de functie van de parlementsleden resulteren in een groot aantal menselijke ziekten en aandoeningen, dus een ingewikkeld begrip van hun structuren blijft een kritische doelstelling voor biologisch onderzoek. Echter, de structuur bepaling van de parlementsleden blijft een belangrijke uitdaging vaak in het kader van hun hydrofobiciteit.
Kamerleden hebben grote hydrofobe regio's ingebed in de bilaag. Wasmiddelen worden vaak gebruikt om deze eiwitten solubiliseren van de bilaag het genereren van een eiwit-detergent micel die vervolgens kan worden gemanipuleerd op een soortgelijke wijze als oplosbare eiwitten. Traditioneel, kristallisatie onderzoeken gaat met behulp van een eiwit-detergent mengsel, maar ze vaak tegen kristallisatie of produceren kristallen van slechte kwaliteit. Deze problemen ontstaan door dereinigingsmiddel niet in staat is adequaat te bootsen de bilaag resulteert in een slechte stabiliteit en heterogeniteit. Daarnaast, het wasmiddel schilden het hydrofobe oppervlak van de MP het verminderen van de beschikbare oppervlakte voor de kristallen contacten. Om deze nadelen te omzeilen Kamerleden kunnen worden gekristalliseerd in lipide media, die nauwer simuleert hun endogene omgeving, en is sinds kort een de novo techniek voor MP kristallisatie.
Lipidische kubieke fase (LCP) is een drie-dimensionale lipide bilaag doorboord door een stelsel van systemen van waterige kanalen 1. Hoewel monoolein is de lipide van keuze, hebben verwante lipiden, zoals monopalmitolein en monovaccenin ook gebruikt om de LCP 2 te maken. Kamerleden zijn opgenomen in de LCP, waar ze verspreiden in drie dimensies en diervoeders kristal kernen. Een groot voordeel van de LCP is dat het eiwit blijft in een meer eigen omgeving, maar de methode heeft een aantal technische nadelen zoals hoge viscositeitosity (die gespecialiseerde apparaten), en de moeilijkheden in kristal visualisatie en manipulatie 3,4. Door deze technische problemen, gebruikten we een ander lipide medium voor kristallisatie-bicelles 5,6 (figuur 1). Bicelles zijn lipide / amfifiele mengsels gevormd door het mengen van een phosphatidylcholine lipide (DMPC) met een amfifiel (CHAPSO) of een korte keten lipide (DHPC). Binnen elke bicelle schijf, de lipide moleculen genereren een bilaag, terwijl de amfifiele moleculen langs de randen van het verstrekken van apolaire gunstige eigenschappen van zowel de dubbellagen en detergenten. Belangrijk is dat beneden hun overgang temperatuur, eiwit-bicelle mengsels hebben een gereduceerde viscositeit en worden gemanipuleerd op een soortgelijke wijze als detergent-oplosbaar parlementsleden, waardoor bicelles compatibel met kristallisatie robots.
Bicelles zijn met succes gebruikt te kristalliseren verschillende membraaneiwitten 5,7-11 (tabel 1). Deze groeiende collectievan eiwitten toont de veelzijdigheid van bicelles voor kristalliseren zowel alfa helix en beta-sheet parlementsleden van prokaryote en eukaryote bronnen. Vanwege deze successen en de eenvoud van high-throughput implementatie, moet bicelles deel uitmaken van arsenaal van elke membraaneiwit kristallograaf's. In deze video beschrijven we de bicelle methodologie en bieden een stap-voor-stap protocol voor het opzetten van high-throughput kristallisatie proeven van gezuiverd Kamerleden met behulp van standaard robotica.
Protocol
Discussion
Bicelles zijn een unieke lipidische media die een native bilaag-achtige omgeving te bieden terwijl ze zelf als oplosbaar gemaakt door detergenten. Deze eigenschap geeft bicelles een duidelijk voordeel ten opzichte van andere lipide-gebaseerde methoden kristallisatie aangezien er geen leercurve of gespecialiseerde apparatuur die nodig is voor deze techniek. Zodra bicelles beschikbaar zijn, zowel commercieel of bereid in het laboratorium, kunnen ze direct worden gemengd met gezuiverd eiwit en vanaf dit moment kristallisat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag Drs bedanken. James Bowie en Salem Faham voor het leveren van technische expertise en adviezen over de bicelle methode en Dr Aviv Paz voor nuttige discussies. Wij erkennen Le Du voor experimentele ondersteuning. Rachna Ujwal heeft financieel belang bij MemX Biosciences LLC, die echter niet ondersteunen dit werk. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de NIH (RO1 GM078844).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMPC | Affymetrix | D514 | |
| CHAPSO | Affymetrix | C317 | |
| Ready-to-use Bicelles | MemX Biosciences | MX201001/MX201002 | |
| Crystallization Screens | Qiagen, Hamptop Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Standard commercially available screens can be used for initial screening | |
| Crystallization Set-up | Standard manual and/or robotic set-up available in lab can be used. |
References
- Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93, 14532-14535 (1996).
- Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Chapter 4 Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. Current Topics in Membranes. 63, 83-108 (2009).
- Nollert, P., Landau, E. M. Enzymic release of crystals from lipidic cubic phases. Biochem. Soc. Trans. 26, 709-713 (1998).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Faham, S., Bowie, J. U. Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure. J. Mol. Biol. 316, 1-6 (2002).
- Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Chapter 5 Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Current Topics in Membranes. 63, 109-125 (2009).
- Faham, S. Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature. Protein Science. 14, 836-840 (2005).
- Luecke, H. Crystallographic structure of xanthorhodopsin, the light-driven proton pump with a dual chromophore. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 16561-16565 (2008).
- Ujwal, R. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 Å resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 17742-17747 (2008).
- Vinothkumar, K. R. Structure of rhomboid protease in a lipid environment. J. Mol. Biol. 407, 232-247 (2011).
- Rasmussen, S. G. F. Crystal structure of the human [bgr]2 adrenergic G-protein-coupled receptor. Nature. 450, 383-387 (2007).
- Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system. Biophys. J. 74, 2405-2418 (1998).
