High-throughput krystallisering av membran proteiner Bruke Lipidic Bicelle Method
Summary
Bicelles er lipid / amphiphile blandinger som opprettholder membran proteiner (MPS) innenfor en lipid bilayer men har unike faseoppførsel som muliggjør high-throughput screening ved krystallisering roboter. Denne teknikken har lykkes produsert en rekke høy oppløsning strukturer fra både prokaryote og eukaryote kilder. Denne videoen beskriver protokoller for å generere lipidic bicelle blandingen, som omfatter parlamentsmedlemmer i bicelle blandingen, sette opp crystallizations studier (manuelt så vel som robotically) og høsting krystaller fra medium.
Abstract
Membran proteiner (MPS) spiller en avgjørende rolle i mange fysiologiske prosesser som pumping spesifikke molekyler over den ellers tette membranen bilayer som omgir alle celler og organeller. Endringer i funksjon av parlamentsmedlemmene resultere i mange menneskers sykdommer og lidelser, derfor forblir en intrikat forståelse av deres strukturer en kritisk mål for biologisk forskning. Imidlertid fortsatt struktur fastsettelse av parlamentsmedlemmer en betydelig utfordring ofte stammer fra hydrofobisitet deres.
Parlamentarikere har betydelige hydrofobe regioner integrert i bilayer. Vaskemidler er ofte brukt for å solubilize disse proteinene fra bilayer generere et protein-vaskemiddel miceller som så kan manipuleres på en lignende måte som løselige proteiner. Tradisjonelt, krystallisering forsøk fortsette å bruke en protein-vaskemiddel blanding, men de ofte motstå krystallisering eller produserer krystaller av dårlig kvalitet. Disse problemene oppstår på grunn avvaskemiddel manglende evne til adekvat etterligne bilayer resulterer i dårlig stabilitet og heterogenitet. I tillegg vaskemiddel skjold den hydrofobe overflaten av MP redusere areal tilgjengelig for krystall kontakter. For å omgå disse ulempene parlamentsmedlemmer kan krystallisert i lipidic media, som nærmere simulerer sine endogene miljø, og har nylig blitt en de novo teknikk for MP krystallisering.
Lipidic kubikk fase (LCP) er en tredimensjonal lipid bilayer penetrert av en sammenvevd system av vandig kanalene 1. Selv monoolein er lipid av valget, har relatert lipider som monopalmitolein og monovaccenin også blitt brukt til å lage LCP 2. Parlamentsmedlemmer er innlemmet i LCP der de diffuse i tre dimensjoner og fôr krystall kjerner. En stor fordel av LCP er at proteinet forblir i et mer naturlig miljø, men metoden har en rekke tekniske ulemper inkludert høy viscosity (krever spesialiserte apparater) og vanskeligheter i krystall visualisering og manipulasjon 3,4. På grunn av disse tekniske problemer, benyttet vi en annen lipidic medium for krystallisering-bicelles 5,6 (Figur 1). Bicelles er lipid / amphiphile blandinger dannes ved å blande en phosphatidylcholine lipid (DMPC) med en amphiphile (CHAPSO) eller en kortkjedede lipid (DHPC). Innenfor hver bicelle platen, lipid molekyler generere en bilayer mens amphiphile molekylene linjen apolar kantene gir gunstige egenskaper av både bilayers og vaskemidler. Viktigere, under deres overgang temperatur, protein-bicelle blandinger har redusert viskositet og er manipulert på en lignende måte som vaskemiddel-solubilisert politikere, noe som gjør bicelles kompatibel med krystallisering roboter.
Bicelles har blitt brukt til å krystallisere flere membran proteiner 5,7-11 (Tabell 1). Denne voksende samlingav proteiner viser allsidigheten til bicelles for krystalliserende både alfa spiralformede og beta sheet parlamentsmedlemmer fra prokaryote og eukaryote kilder. På grunn av disse suksessene, og enkelhet i high-throughput implementering, bør bicelles være en del av hver membran protein crystallographer arsenal. I denne videoen, beskriver vi bicelle metodikk og gir en steg-for-steg-protokoll for å sette opp high-throughput krystallisering studier av renset parlamentsmedlemmer med standard robotikk.
Protocol
Discussion
Bicelles er en unik lipidic media som tilbyr en innfødt bilayer-lignende miljø mens oppfører seg som om solubilisert av vaskemidler. Denne egenskapen gir bicelles en klar fordel over andre lipid-baserte krystallisering metoder ettersom det ikke er noen læringskurve eller spesialisert utstyr som kreves for denne teknikken. Når bicelles er tilgjengelige, enten kommersielle eller tilberedes i laboratoriet, kan de være direkte blandet med renset protein, og fra dette punktet på krystallisering forsøk fortsette neste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke Drs. James Bowie og Salem Faham for å gi teknisk ekspertise og veiledning om bicelle metoden og Dr. Aviv Paz for nyttige diskusjoner. Vi erkjenner Le Du for eksperimentell støtte. Rachna Ujwal har økonomisk interesse i MemX biovitenskap LLC, som imidlertid ikke støtte dette arbeidet. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra NIH (RO1 GM078844).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMPC | Affymetrix | D514 | |
| CHAPSO | Affymetrix | C317 | |
| Ready-to-use Bicelles | MemX Biosciences | MX201001/MX201002 | |
| Crystallization Screens | Qiagen, Hamptop Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Standard commercially available screens can be used for initial screening | |
| Crystallization Set-up | Standard manual and/or robotic set-up available in lab can be used. |
References
- Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93, 14532-14535 (1996).
- Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Chapter 4 Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. Current Topics in Membranes. 63, 83-108 (2009).
- Nollert, P., Landau, E. M. Enzymic release of crystals from lipidic cubic phases. Biochem. Soc. Trans. 26, 709-713 (1998).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Faham, S., Bowie, J. U. Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure. J. Mol. Biol. 316, 1-6 (2002).
- Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Chapter 5 Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Current Topics in Membranes. 63, 109-125 (2009).
- Faham, S. Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature. Protein Science. 14, 836-840 (2005).
- Luecke, H. Crystallographic structure of xanthorhodopsin, the light-driven proton pump with a dual chromophore. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 16561-16565 (2008).
- Ujwal, R. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 Å resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 17742-17747 (2008).
- Vinothkumar, K. R. Structure of rhomboid protease in a lipid environment. J. Mol. Biol. 407, 232-247 (2011).
- Rasmussen, S. G. F. Crystal structure of the human [bgr]2 adrenergic G-protein-coupled receptor. Nature. 450, 383-387 (2007).
- Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system. Biophys. J. 74, 2405-2418 (1998).
