В пробирке раздевания ВИЧ-1 сердечников
Summary
Раздевания является важным шагом на ранней стадии ВИЧ-1, жизненного цикла и определяется как разборку капсида оболочки и высвобождение вирусного комплекс рибонуклеопротеидных (vRNP). Здесь мы демонстрируем методы выделения нетронутыми ядер от ВИЧ-1 вирионов и для количественного их раздевания<em> В пробирке</em>.
Abstract
Геном ретровируса заключен в капсид окружен липидной оболочкой. Для лентивирусов, таких как ВИЧ-1, конической оболочки капсида состоит из белка CA расположены в виде решетки из шестиугольника. Капсида закрыто 7 пентамеры на широком конце и 5 на узкий конец конуса 1, 2. Заключенная в этой оболочки капсида является вирусный комплекс рибонуклеопротеидных, а вместе они составляют ядро.
После слияния вирусной мембраны с мембраной клетки-мишени, ВИЧ-1 поступает в цитоплазму. Капсида то разбирает освобождения свободного ЦА в растворимой форме 3 в процесс называется раздевания. Внутриклеточные места и времени проведения ВИЧ-1 раздевания мало изучены. Одноместный аминокислотных замен в ЦА, которые изменяют стабильность капсида также ослабить способность ВИЧ-1, чтобы инфицировать клетки 4. Это означает, что стабильность капсид имеет решающее значение для ВИЧ-1 инфекции. </p>
ВИЧ-1 раздевания было трудно учиться из-за отсутствия свободных мест в чувствительных и надежных тестов для этого процесса. Здесь мы опишем количественный метод исследования раздевания в пробирке использованием ядра изолированы от инфекционных ВИЧ-1 частиц. Подход предполагает выделение ядер путем осаждения концентрированных вирионов через слой моющего средства и в линейный градиент сахарозы, в холод. Для количественной оценки раздевания, изолированных ядер инкубируют при 37 ° С для различных определенные интервалы времени, а затем осаждали ультрацентрифугирования. Степень раздевания анализируется количественная доля ЦА в супернатант. Этот подход был применен для анализа последствий вирусных мутаций на ВИЧ-1 капсида стабильности 4, 5, 6. Следует также полезны для изучения роли клеточных факторов ВИЧ-1 раздевания.
Protocol
Discussion
Метод, описанный здесь, чтобы очистить ВИЧ-1 ядер для изучения раздевания в пробирке полезна для изучения этой стадии ВИЧ-1 жизненного цикла, особенно из-за отсутствия утвержденным методом для анализа на ВИЧ-1 раздевания в клетках-мишенях. Хотя этот метод использует равновесия ультрацен…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ВИЧ-1 раздевания исследования в лаборатории Эйкена были поддержаны грантами NIH AI40364, AI50423 и AI076121. Несколько ключевых материалов, в том числе реагенты, используемые в p24 ELISA, были предоставлены NIH исследований СПИДа и справочные программы, Отдел СПИДа, NIAID, NIH.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
3957 | |
|
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 |
References
- Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core. Science. 283, 80-83 (1999).
- Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein. Nature. 407, 409-413 (2000).
- Aiken, C. Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating. Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).
- Forshey, B. M., Schwedler, U. v. o. n., Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).
- Forshey, B. M., Aiken, C. Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex. J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).
- Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating. Virology. 358, 48-54 (2007).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Aiken, C., Prasad, V. R., Ganjam, K. V. . Methods in Molecular Biology. 485, 41-53 (2009).
- Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core. J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).
- Kewalramani, V. N., Emerman, M. Vpx association with mature core structures of HIV-2. Virology. 218, 159-168 (1996).
- Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12, 288-293 (1997).
- Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kräusslich, H. G. Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).
- Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kräusslich, H. G., Fuller, S. D. Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores. EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).
- Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. Uncoating of HIV-1 requires cellular activation. Virology. 337, 93-101 (2005).
- Accola, M. A., Ohagen, A., Göttlinger, H. G. Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag. J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).
