Summary
Uncoating er et væsentligt skridt i den tidlige fase af HIV-1 livscyklus og er defineret som demonteringen af kapsid skallen og frigivelsen af den virale ribonucleoprotein kompleks (vRNP). Her vil vi demonstrere teknikker til at isolere intakte kerner fra HIV-1 virioner og til at kvantificere deres uncoating<em> In vitro</em>.
Abstract
Genomet i retrovira er indkapslet i en kapsid omgivet af en lipid kuvert. For lentiviruses, såsom HIV-1, er den koniske kapsid skallen består af CA protein arrangeret som et gitter af sekskant. Den kapsid er lukket med 7 pentamers ved den brede ende og 5 på den smalle ende af keglen 1, 2. Indkapslet i denne kapsid Shell er den virale ribonucleoprotein komplekse, og sammen udgør de kernen.
Efter fusion af det virale membran med målet cellemembranen, er HIV-1 frigives til cytoplasma. Den kapsid Derefter disassembles slippe fri CA i opløselig form 3 i en proces kaldet uncoating. Den intracellulære placering og timing af HIV-1 uncoating er dårligt forstået. Single amino-syre udskiftninger i CA, der ændrer den stabilitet kapsid også gøre det sværere for HIV-1 til at inficere celler 4. Dette indikerer, at stabiliteten af kapsid er kritisk for HIV-1 infektion. </p>
HIV-1 uncoating har det været vanskeligt at studere på grund af manglende adgang til følsomme og pålidelige assays til denne proces. Her beskriver vi en kvantitativ metode til at studere uncoating in vitro med kerner isoleret fra smitsom HIV-1-partikler. Den tilgang indebærer isolering af kerner ved sedimentation af koncentreret virioner gennem et lag af vaskemiddel og ind i en lineær saccharose gradient, i kulden. For at kvantificere uncoating, er den isolerede kerner inkuberes ved 37 ° C for forskellige timede intervaller og efterfølgende piller ved ultracentrifugering. Omfanget af uncoating analyseres ved at kvantificere den fraktion af CA i supernatant. Denne tilgang har været ansat til at analysere effekten af viral mutationer på HIV-1 kapsid stabilitet 4, 5, 6. Det bør også være nyttigt for undersøgelser af betydningen af cellulære faktorer i HIV-1 uncoating.
Protocol
Discussion
Den metode, der beskrives her for at rense HIV-1-kerner for at studere uncoating in vitro er nyttigt til at studere denne fase af HIV-1 livscyklus, især på grund af manglende adgang til en valideret metode til at analysere HIV-1 uncoating i target-cellerne. Selv om denne metode bruger ligevægt ultracentrifugering at rense kerner, andre har brugt direkte pelletering efter korte lyse med 1% Triton-X-100 12, 13 eller pelletering gennem et saccharose pude overlejret med 0,1% Triton-X-100 14, 15. </p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HIV-1 uncoating studier i Aiken laboratoriet blev støttet af NIH tilskud AI40364, AI50423 og AI076121. Flere vigtige materialer, herunder reagenser, der anvendes i p24 ELISA, blev tilvejebragt af NIH aids-forskning og referenceprogram, division af aids, NIAID, NIH.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
3957 | |
|
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 |
References
- Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core. Science. 283, 80-83 (1999).
- Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein. Nature. 407, 409-413 (2000).
- Aiken, C. Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating. Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).
- Forshey, B. M., Schwedler, U. v. o. n., Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).
- Forshey, B. M., Aiken, C. Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex. J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).
- Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating. Virology. 358, 48-54 (2007).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Aiken, C., Prasad, V. R., Ganjam, K. V. . Methods in Molecular Biology. 485, 41-53 (2009).
- Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core. J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).
- Kewalramani, V. N., Emerman, M. Vpx association with mature core structures of HIV-2. Virology. 218, 159-168 (1996).
- Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12, 288-293 (1997).
- Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kräusslich, H. G. Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).
- Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kräusslich, H. G., Fuller, S. D. Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores. EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).
- Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. Uncoating of HIV-1 requires cellular activation. Virology. 337, 93-101 (2005).
- Accola, M. A., Ohagen, A., Göttlinger, H. G. Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag. J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).
