In vitro uncoating van HIV-1 Kernen
Summary
Uncoating is een essentiële stap in de vroege fase van de HIV-1 levenscyclus en wordt gedefinieerd als de demontage van het capside shell en de vrijlating van de virale ribonucleoproteïne complex (vRNP). Hier tonen we technieken voor het isoleren van intacte kernen van HIV-1 virionen en voor de kwantificering van hun uncoating<em> In vitro</em>.
Abstract
Het genoom van de retrovirussen is ingekapseld in een capside, omringd door een lipide envelop. Voor lentivirussen, zoals HIV-1, is de conische capside schil bestaat uit CA eiwit ingericht als een rooster van zeshoek. De capside wordt afgesloten door 7 pentamers aan het brede uiteinde en 5 aan het smalle uiteinde van de kegel 1, 2. Ingekapseld in dit capside shell is de virale ribonucleoproteïne complex, en samen vormen ze de kern.
Na fusie van de virale membraan met het doel celmembraan, is het HIV-1 vrij in het cytoplasma. De capside demonteert dan het vrijgeven van gratis CA in de oplosbare vorm 3 in een proces aangeduid als uncoating. De intracellulaire locatie en het tijdstip van de HIV-1 uncoating worden slecht begrepen. Enkel aminozuur substituties in Californië, dat de stabiliteit van de capside te veranderen ook afbreuk doen aan het vermogen van HIV-1 tot 4 cellen te infecteren. Dit geeft aan dat de stabiliteit van de capside is essentieel voor HIV-1 infectie. </p>
HIV-1 uncoating is moeilijk te bestuderen door een gebrek aan beschikbaarheid van gevoelige en betrouwbare tests voor dit proces. Hier beschrijven we een kwantitatieve methode voor het bestuderen van uncoating in vitro gebruik van kernen geïsoleerd van besmettelijke HIV-1 deeltjes. De aanpak omvat isolement van kernen door sedimentatie van geconcentreerde virionen door een laag van het wasmiddel en in een lineaire sucrose gradiënt, in de kou. Te kwantificeren uncoating, zijn de geïsoleerde kernen geïncubeerd bij 37 ° C voor verschillende getimede intervallen en vervolgens gepelleteerd door ultracentrifugatie. De omvang van uncoating wordt geanalyseerd door het kwantificeren van de fractie van CA in het supernatant. Deze benadering is gebruikt om effecten van virale mutaties te analyseren op HIV-1 capside stabiliteit 4, 5, 6. Het zou ook nuttig zijn voor het bestuderen van de rol van cellulaire factoren die bij HIV-1 uncoating.
Protocol
Discussion
De hier beschreven methode om HIV-1 kernen te zuiveren om te studeren uncoating in vitro is handig voor het bestuderen van deze fase van de HIV-1 levenscyclus, in het bijzonder als gevolg van onbeschikbaarheid van een gevalideerde methode om HIV-1 uncoating analyseren doelcellen. Hoewel deze methode gebruikt evenwicht ultracentrifugatie te zuiveren kernen, anderen hebben gebruikt direct pilleren na korte lyse met 1% Triton-X-100 12, 13 of pelletering door een sucrose kussen bedekt met 0,1% Triton-X-100 1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HIV-1 uncoating studies in het laboratorium Aiken werden ondersteund door NIH beurzen AI40364, AI50423 en AI076121. Diverse belangrijke stoffen, waaronder reagentia gebruikt in de p24-ELISA, werden verstrekt door de NIH AIDS-onderzoek en Reference Program, Afdeling van aids, NIAID, NIH.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
3957 | |
|
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 |
References
- Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core. Science. 283, 80-83 (1999).
- Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein. Nature. 407, 409-413 (2000).
- Aiken, C. Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating. Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).
- Forshey, B. M., Schwedler, U. v. o. n., Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).
- Forshey, B. M., Aiken, C. Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex. J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).
- Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating. Virology. 358, 48-54 (2007).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Aiken, C., Prasad, V. R., Ganjam, K. V. . Methods in Molecular Biology. 485, 41-53 (2009).
- Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core. J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).
- Kewalramani, V. N., Emerman, M. Vpx association with mature core structures of HIV-2. Virology. 218, 159-168 (1996).
- Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12, 288-293 (1997).
- Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kräusslich, H. G. Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).
- Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kräusslich, H. G., Fuller, S. D. Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores. EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).
- Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. Uncoating of HIV-1 requires cellular activation. Virology. 337, 93-101 (2005).
- Accola, M. A., Ohagen, A., Göttlinger, H. G. Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag. J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).
