In vitro Uncoating von HIV-1-Kerne
Summary
Uncoating ist ein wesentlicher Schritt in der frühen Phase der HIV-1 Lebenszyklus und wird als der Demontage der Kapsid-Shell und die Freisetzung des viralen Ribonukleoproteinkomplex (vRNP) definiert. Hier zeigen wir Techniken zur Isolierung von intakten Kernen aus HIV-1 Virionen und zur Quantifizierung ihrer uncoating<em> In-vitro-</em>.
Abstract
Das Genom der Retroviren ist verpackt in einem Kapsid von einer Lipid-Hülle umgeben. Für Lentiviren wie HIV-1, ist die konische Kapsid Schale CA-Protein als ein Gitter aus Sechseck angeordnet sind. Das Kapsid ist um 7 Pentamere auf das breite Ende und 5 am schmalen Ende des Konus 1, 2 geschlossen. Eingeschlossen in diese Kapsid-Shell ist die virale Ribonukleoproteinkomplex, und zusammen umfassen sie den Kern.
Nach der Fusion der Virushülle mit der Zellmembran Ziel ist die HIV-1 in das Zytoplasma freigesetzt. Das Capsid dann zerlegt veröffentlicht kostenlose CA in die lösliche Form 3 in einem Prozess genannt uncoating. Die intrazelluläre Ort und Zeitpunkt des HIV-1 uncoating sind weitgehend unverstanden. Einzel-Aminosäure-Substitutionen in CA, dass die Stabilität des Kapsid verändern ebenfalls beeinträchtigen die Fähigkeit des HIV-1 auf Zellen 4 zu infizieren. Dies deutet darauf hin, dass die Stabilität des Kapsid von entscheidender Bedeutung für HIV-1 Infektion ist. </p>
HIV-1 uncoating wurde schwer Studie aufgrund mangelnder Verfügbarkeit von sensitiven und zuverlässigen Tests für diesen Prozess. Hier beschreiben wir eine quantitative Methode zur Untersuchung uncoating in vitro mit Kernen von infektiösen HIV-1 Partikel isoliert. Der Ansatz beinhaltet Isolierung der Kerne durch Sedimentation von konzentrierten Virionen durch eine Schicht von Wasch-und in eine lineare Saccharose-Gradienten, in der Kälte. Zur Quantifizierung uncoating werden die isolierten Kerne bei 37 ° C für verschiedene Zeitintervalle und anschließend pelletiert durch Ultrazentrifugation. Das Ausmaß der uncoating wird durch die Quantifizierung der Anteil der CA in den Überstand analysiert. Dieser Ansatz wurde eingesetzt, um Effekte von viralen Mutationen auf HIV-1 Capsid Stabilität 4, 5, 6 zu analysieren. Es sollte auch für die Untersuchung der Rolle zellulärer Faktoren in HIV-1 uncoating.
Protocol
Discussion
Die hier beschriebene Methode zur HIV-1-Kerne zu reinigen, um studieren uncoating in vitro ist für das Studium dieser Phase der HIV-1 Lebenszyklus, vor allem aufgrund der Nichtverfügbarkeit eine validierte Methode zur HIV-1 uncoating in Zielzellen zu analysieren nützlich. Obwohl diese Methode verwendet Gleichgewicht Ultrazentrifugation zu Kernen zu reinigen, andere haben direkte Pelletierung nach kurzer Lyse verwendet mit 1% Triton-X-100 12, 13 oder Pelletierung durch eine Saccharose-Kissen mit 0,1% Triton…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HIV-1 uncoating Studien in den Aiken Labor wurden von NIH gewährt AI40364, AI50423 und AI076121 unterstützt. Mehrere wichtige Materialien, einschließlich Reagenzien in der p24 ELISA verwendet wurden, wurden durch die NIH AIDS Research and Reference Program, Division of AIDS, NIAID, NIH zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
3957 | |
|
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 |
References
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