एचआईवी-1 कोर की इन विट्रो Uncoating में
Summary
Uncoating एचआईवी -1 जीवन चक्र के प्रारंभिक चरण में एक आवश्यक कदम है और capsid खोल के disassembly और वायरल ribonucleoprotein जटिल (vRNP) की रिहाई के रूप में परिभाषित है. यहाँ, हम एचआईवी-1 virions से बरकरार कोर अलग करने के लिए और उनके uncoating बढ़ाता लिए तकनीक का प्रदर्शन<em> इन विट्रो में</em>.
Abstract
रेट्रोवायरस के जीनोम एक लिपिड लिफाफा से घिरा capsid में encased है. Lentiviruses, जैसे एचआईवी -1 के लिए, शंक्वाकार capsid खोल सीए षट्भुज का एक जाली के रूप में व्यवस्थित प्रोटीन से बना है. capsid व्यापक अंत में 7 pentamers और कोन 1, 2 की संकीर्ण अंत में 5 द्वारा बंद कर दिया है. इस capsid खोल में encased वायरल ribonucleoprotein जटिल है, और एक साथ वे कोर शामिल है.
लक्ष्य कोशिका झिल्ली के साथ वायरल झिल्ली के विलय के बाद, एचआईवी -1 cytoplasm में जारी है. capsid तो एक uncoating के रूप में संदर्भित प्रक्रिया में घुलनशील रूप में 3 मुक्त सीए रिहा disassembles. intracellular और एचआईवी-1 uncoating के स्थान और समय खराब समझ रहे हैं. सीए में एकल एमिनो एसिड substitutions है कि capsid की स्थिरता में परिवर्तन भी 4 कोशिकाओं को संक्रमित एचआईवी -1 की क्षमता क्षीण है. यह इंगित करता है कि capsid की स्थिरता एचआईवी -1 संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण है. </p>
एचआईवी-1 uncoating मुश्किल हो गया है इस प्रक्रिया के लिए संवेदनशील और विश्वसनीय assays की उपलब्धता की कमी के कारण अध्ययन. यहाँ हम संक्रामक एचआईवी-1 कणों से अलग कोर का उपयोग कर इन विट्रो में uncoating के अध्ययन के लिए एक मात्रात्मक विधि का वर्णन . दृष्टिकोण डिटर्जेंट की एक परत के माध्यम से और एक रैखिक sucrose ढाल में केंद्रित virions के अवसादन द्वारा कोर के अलगाव, ठंड में शामिल है. Uncoating यों, पृथक कोर 37 पर incubated हैं ° सी के विभिन्न समय के अंतराल बाद ultracentrifugation द्वारा pelleted के लिए. uncoating की हद तक सतह पर तैरनेवाला में सीए के अंश बढ़ाता द्वारा विश्लेषण किया है. यह दृष्टिकोण एचआईवी-1 capsid 4 स्थिरता, 5, 6 पर वायरल परिवर्तन के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए नियोजित किया गया है. यह भी एचआईवी-1 uncoating में सेलुलर कारकों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होना चाहिए.
Protocol
Discussion
विधि यहाँ वर्णित करने के लिए एचआईवी – एक कोर को शुद्ध करने के लिए इन विट्रो में uncoating एचआईवी -1 जीवन चक्र के इस चरण में, विशेष रूप से एक मान्य पद्धति की अनुपलब्धता के कारण लक्ष्य कोशिकाओं में एचआईवी -1 uncoating विश?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एचआईवी 1 Aiken प्रयोगशाला में uncoating अध्ययन एनआईएच AI40364 अनुदान, AI50423 और AI076121 द्वारा समर्थित थे. P24 एलिसा में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों सहित कई महत्वपूर्ण सामग्री, NIH एड्स अनुसंधान और संदर्भ प्रोग्राम, एड्स के प्रभाग, NIAID, एनआईएच द्वारा प्रदान किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
3957 | |
|
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 |
References
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