In uncoating vitro di HIV-1 Cores
Summary
Uncoating è un passo essenziale nella fase iniziale del ciclo di vita di HIV-1 ed è definito come lo smontaggio del guscio capside e il rilascio del complesso ribonucleoproteina virale (vRNP). In questo studio dimostriamo tecniche per isolare nuclei intatti da HIV-1 virioni e per quantificare la loro uncoating<em> In vitro</em>.
Abstract
Il genoma dei retrovirus è racchiuso in un capside circondato da un involucro lipidico. Per i lentivirus, come l'HIV-1, la conchiglia conica capside è composto di proteine CA disposti come un reticolo di esagono. Il capside è chiuso da 7 pentameri alla fine ampio e 5 alla parte più stretta del cono 1, 2. Racchiuso in questa shell capside è il complesso ribonucleoproteina virale, e insieme costituiscono il nucleo.
In seguito alla fusione della membrana virale con la membrana della cellula bersaglio, di HIV-1 è rilasciata nel citoplasma. Il capside poi smonta il rilascio gratuito CA in forma solubile 3 in un processo denominato uncoating. La posizione intracellulare e la tempistica di HIV-1 uncoating sono poco conosciuti. Singolo aminoacido sostituzioni in CA che alterano la stabilità del capside anche compromettere la capacità del virus HIV-1 di infettare le cellule 4. Ciò indica che la stabilità del capside è fondamentale per HIV-1. </p>
HIV-1 uncoating è stata difficile da studiare a causa della mancanza di disponibilità di test sensibile e affidabile per questo processo. Qui si descrive un metodo quantitativo per lo studio in vitro utilizzando uncoating nuclei isolati da infezioni HIV-1 particelle. L'approccio prevede l'isolamento dei nuclei per sedimentazione di virioni concentrati attraverso uno strato di detergente e in un gradiente di saccarosio lineare, al freddo. Per quantificare uncoating, i nuclei isolati sono incubati a 37 ° C per diversi intervalli di tempo e poi pellet da ultracentrifugazione. Il grado di uncoating è analizzato da quantificare la frazione di CA nel surnatante. Questo approccio è stato impiegato per analizzare gli effetti delle mutazioni virale HIV-1 la stabilità del capside 4, 5, 6. Dovrebbe anche essere utile per studiare il ruolo dei fattori cellulari di HIV-1 uncoating.
Protocol
Discussion
Il metodo qui descritto per purificare l'HIV-1 core per studiare uncoating in vitro è utile per lo studio di questa fase del ciclo di HIV-1 vita, soprattutto a causa di indisponibilità di un metodo convalidato di analisi uncoating HIV-1 nelle cellule bersaglio. Anche se questo metodo utilizza ultracentrifugazione equilibrio per purificare core, altri ricercatori hanno utilizzato pellettizzazione diretta dopo breve lisi con 1% Triton X-100-12, 13 o cubettatura attraverso un cuscino di saccarosio sovrappo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HIV-1 uncoating studi in laboratorio Aiken sono stati sostenuti da sovvenzioni NIH AI40364, AI50423 e AI076121. Diversi materiali chiave, tra cui i reagenti utilizzati nel p24 ELISA, sono state fornite dal NIH AIDS programma di ricerca e di riferimento, Divisione di AIDS, NIAID, NIH.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
3957 | |
|
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 |
References
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