HIV - 1 코어의 시험 관내 Uncoating에서
Summary
Uncoating는 HIV – 1 수명주기의 초기 단계에 필수적인 단계이며 capsid 쉘의 해체와 바이러스 ribonucleoprotein 복합 (vRNP)의 출시로 정의됩니다. 여기, 우리는 HIV – 1 virions에서 그대로 코어를 분리 및 그들의 uncoating을 quantifying 기술을 입증<em> 체외에서</em>.
Abstract
retroviruses의 게놈은 지질 봉투에 둘러싸인 capsid으로 쌌다는 것입니다. 이러한 HIV – 1과 같은 lentiviruses, 들어, 원뿔 capsid의 껍질은 육각의 격자로 배열 CA 단백질로 구성되어 있습니다. capsid는 원추 1, 2의 좁은 끝에 7 광범 끝에 pentamers와 5 닫힙니다. 이 capsid의 쉘으로 쌌다는 바이러스 ribonucleoprotein 복합이며, 함께 그들은 코어를 구성.
대상 세포막과 바이러스 세포막의 융합에 따라, HIV – 1은 세포질에 발표됩니다. capsid 다음 uncoating이라고도 과정에서 용해 형태로 3 무료 CA를 방출 disassembles. HIV – 1 uncoating의 세포내 위치와 타이밍을 제대로 이해하고 있습니다. capsid의 안정성을 변경 CA에서 단일 아미노 산 대체는 또한 세포 4 감염 HIV – 1의 능력을 손상. 이것은 capsid의 안정성은 HIV – 1 감염에 대해 중요한 것을 나타냅니다. </p>
HIV – 1 uncoating이 프로세스에 대한 민감하고 안정적인 assays의 가용성의 부족으로 인해 공부를 어렵게되었습니다. 여기 감염 HIV – 1 입자로부터 분리된 코어를 사용하여 체외에서 uncoating 공부를위한 양적 방법을 설명합니다. 접근 방식은 추위에 세제의 계층 통해 선형 자당 기울기에 집중 virions의 침강에 의해 코어의 고립을 포함한다. uncoating 계량하려면, 분리된 코어는 37 incubated 아르 ° C 각종 초과 간격 및 ultracentrifugation에 의해 연속적으로 pelleted하십시오. uncoating의 범위가 뜨는에서 CA의 분율을 quantifying 의해 분석됩니다. 이 접근은 HIV – 1 capsid 안정성 4, 5, 6에서 바이러스 변이의 효과를 분석하기 위해 고용되었습니다. 또한 HIV – 1 uncoating의 세포 요소의 역할을 공부하는 데 유용합니다.
Protocol
Discussion
이 메서드는 대상 세포에서 HIV – 1 uncoating을 분석 검증 방법 unavailability 특히 인해 HIV – 1 수명주기의이 단계를 공부하는 데 유용합니다 체외에서 uncoating 공부 HIV – 1 코어를 정화하려면 여기를 설명했다. 이 방법은 코어를 정화 평형 ultracentrifugation를 사용하지만, 다른 사람들이 한때 용해 후 직접 pelleting를 사용한 1퍼센트 트리톤 – X – 100 12, 13 또는 0.1 % 트리톤 – X – 100 14, 15 겹쳐 자당…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HIV – 1 에이 킨 실험실에서 uncoating 연구는 NIH 보조금 AI40364, AI50423 및 AI076121 지원했다. p24 엘리사에 사용되는 시약을 포함한 몇 가지 주요 자료, NIH AIDS 연구 및 레퍼런스 프로그램, 에이즈 학부, NIAID, NIH에 의해 제공되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
3957 | |
|
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 |
References
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