Summary
Desencapsulamento é um passo essencial na fase inicial do ciclo de vida do HIV-1 e é definido como a desmontagem do shell capsídeo ea liberação do complexo de ribonucleoproteína viral (vRNP). Aqui, nós demonstrar técnicas para isolar núcleos intactos de HIV-1 virions e para quantificar a sua desencapsulamento<em> In vitro</em>.
Abstract
O genoma do retrovírus é envolto em um capsídeo cercada por um envelope lipídico. Para lentivírus, como o HIV-1, o shell do capsídeo cônica é composto de proteína CA organizados como uma rede de hexágono. O capsídeo é fechada por sete pentamers no final largo e 5 na parte mais estreita do cone 1, 2. Encerradas nesta shell capsídeo é o complexo ribonucleoproteína viral, e juntos eles compõem o núcleo.
Após a fusão da membrana viral com a membrana da célula-alvo, o HIV-1 é liberada no citoplasma. O capsídeo, em seguida, liberando desmonta CA livre na forma solúvel 3 em um processo conhecido como desencapsulamento. A localização intracelular eo calendário de HIV-1 desencapsulamento são mal compreendidos. Único amino-ácido substituições em CA que alteram a estabilidade do capsídeo também prejudicar a capacidade do HIV-1 para infectar as células 4. Isso indica que a estabilidade do capsídeo é crítico para infecção VIH-1. </p>
HIV-1 desencapsulamento tem sido difícil de estudar por falta de disponibilidade de ensaios sensíveis e confiáveis para este processo. Aqui nós descrevemos um método quantitativo para o estudo in vitro utilizando desencapsulamento núcleos isolados de HIV-1 infecciosas partículas. A abordagem envolve o isolamento de núcleos por sedimentação de partículas virais concentradas através de uma camada de detergente e em um gradiente de sacarose linear, no frio. Para quantificar desencapsulamento, os núcleos isolados são incubados a 37 ° C para vários intervalos de tempo e posteriormente peletizadas por ultracentrifugação. A extensão da desencapsulamento é analisada pela quantificação da fração do CA no sobrenadante. Esta abordagem tem sido empregada para analisar os efeitos das mutações virais do HIV-1 estabilidade capsídeo 4, 5, 6. Deve também ser útil para estudar o papel dos fatores celulares em HIV-1 desencapsulamento.
Protocol
Discussion
O método descrito aqui para purificar HIV-1 núcleos para estudar desencapsulamento in vitro é útil para estudar esta fase do ciclo de vida do HIV-1, especialmente devido à indisponibilidade de um método validado para analisar HIV-1 desencapsulamento em células-alvo. Embora este método usa ultracentrifugação equilíbrio para purificar núcleos, outros autores utilizaram a peletização direta após lise breve com 1% Triton X-100-12, 13 ou peletização através de uma almofada de sacarose sobrepostas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HIV-1 desencapsulamento estudos em laboratório Aiken foram apoiados pelo NIH concede AI40364, AI50423 e AI076121. Vários materiais-chave, incluindo reagentes utilizados na ELISA p24, foram fornecidos pelo NIH AIDS Programa de Pesquisa e Referência, da Divisão de AIDS, NIAID, NIH.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
3957 | |
|
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 |
References
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