Uncoating HIV-1 yaşam döngüsünün ilk aşamasında önemli bir adım ve kapsid kabuk sökülmesi ve viral ribonükleoprotein kompleksi (vRNP) serbest bırakılması olarak tanımlanır. Burada, HIV-1 virionlar sağlam çekirdek tecrit ve bunların uncoating ölçülmesi için teknikleri göstermek<em> In vitro</em>.
Retrovirüsler genom lipid bir zarf tarafından çevrili bir kapsid kaplı. HIV-1 olarak lentiviruses için altıgen bir kafes olarak düzenlenmiştir CA protein, konik kapsid kabuk oluşur. Kapsid dar sonunda koni 1, 2, 7 pentamers geniş sonunda ve 5 kapalı . Bu kapsid kabuk kaplı viral ribonükleoprotein kompleksi ve birlikte çekirdek oluşturur.
HIV-1, hedef hücre zarı ile viral membran füzyonu takiben, sitoplazmaya salınır. Kapsid sonra uncoating olarak adlandırılan bir süreç içinde çözünür formu 3 CA serbest bırakmadan sökülebilir. HIV-1 uncoating hücre içi konumu ve zamanlama tam olarak anlaşılamamıştır. Kapsid istikrarı değiştirmez CA Tek amino asit yer değiştirmelerin hücreleri 4 bulaştırmak için de HIV-1 yeteneğini bozar. Bu kapsid istikrarı HIV-1 enfeksiyonu için kritik olduğunu gösterir. </p>
HIV-1 uncoating Bu işlem için duyarlı ve güvenilir testlerin mevcudiyeti eksikliği nedeniyle çalışma zor olmuştur. Burada bulaşıcı HIV-1 parçacıkları izole çekirdeği kullanılarak in vitro uncoating çalışmak için kantitatif bir yöntem açıklanmaktadır. Yaklaşımı soğuk, deterjan ve doğrusal bir sukroz gradient katmanı üzerinden konsantre virionlar sedimentasyon çekirdek izolasyonu içerir. Uncoating ölçmek için, izole çekirdek 37 inkübe ° C çeşitli zaman aralıklarında ve Ultrasantrifügasyon tarafından sonradan pelet. Uncoating kapsamı süpernatantı CA kısmını nicel analiz edilir. Bu yaklaşım, HIV-1 kapsid istikrar 4, 5, 6 viral mutasyonların etkilerini analiz etmek için istihdam edilmiştir . Ayrıca HIV-1 uncoating hücresel faktörlerin rol çalışmak için yararlı olacaktır.
Bu yöntem, hedef hücreleri, HIV-1 uncoating analiz etmek için geçerli bir yöntem olmaması nedeniyle bu aşamada, HIV-1 yaşam döngüsü eğitimi için yararlı in vitro uncoating çalışmada HIV-1 çekirdek arındırmak için buraya nitelendirdi. Bu yöntem, çekirdek arındırmak için denge Ultrasantrifügasyon kullanıyor olsa da, diğerleri ile kısa Parçalama işleminden sonra doğrudan peletleme kullandık% 1 Triton X-100, 12, 13 ya da% 0,1 Triton X-100, 14, 15 ile üst üste sakaroz…
The authors have nothing to disclose.
HIV-1 Aiken laboratuvar uncoating çalışmalar NIH hibe AI40364 AI50423 ve AI076121 tarafından desteklenmiştir. P24 ELISA kullanılan reaktifler de dahil olmak üzere birçok önemli malzemeler, NIH AIDS Araştırma ve Referans Programı, AIDS Bölümü, NIAID, NIH tarafından verilmiştir.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc | 9002-93-1 | |
Tween 20 | Acros | 9005-64-5 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
3957 | |
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce | 31130 | |
HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Scientific | 3455 | |
SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
High speed microfuge tubes | Beckman Coulter | 326823, 358123, 357448 | |
Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 |