Uncoating في المختبر من HIV - 1 النوى
Summary
Uncoating هو خطوة ضرورية في مرحلة مبكرة من دورة الحياة HIV – 1 ، ويعرف بأنه تفكك قذيفة قفيصة والإفراج عن مجمع بروتين نووي ريبوزي الفيروسي (vRNP). هنا ، علينا أن نظهر تقنيات لعزل نواة سليمة من virions HIV – 1 لقياس وuncoating بهم<em> في المختبر</em>.
Abstract
الجينوم من الفيروسات القهقرية هو المغطى في قفيصة محاطة المغلف الدهون. لlentiviruses ، مثل HIV – 1 ، وتتألف القشرة قفيصة المخروطية من البروتين CA رتبت بوصفها شعرية من مسدس. إغلاق قفيصة pentamers بنسبة 7 في نهاية اسعة و 5 في نهاية الضيقة للمخروط 1 و 2. المغطى في هذه القذيفة قفيصة هو مجمع بروتين نووي ريبوزي الفيروسية ، وأنهم يشكلون معا جوهر.
بعد الانصهار في الغشاء الفيروسية مع غشاء الخلية المستهدفة ، يتم الافراج عن HIV – 1 في السيتوبلازم. قفيصة ثم يفكك الافراج CA الحرة في شكل قابل للذوبان 3 في عملية يشار إلى uncoating. ولا يزال الغموض يكتنف مكان وتوقيت الخلايا HIV – 1 uncoating. الأحماض الأمينية واحد التبديلات في كاليفورنيا التي تغير على استقرار قفيصة يضعف أيضا قدرة HIV – 1 إلى 4 تصيب الخلايا. هذا يدل على أن الاستقرار في قفيصة هو أمر حاسم لHIV – 1 العدوى. </p>
وقد HIV – 1 uncoating الصعب دراسة نظرا لعدم توافر فحوصات حساسة وموثوقة لهذه العملية. نحن هنا وصف الأسلوب الكمي للدراسة في المختبر باستخدام uncoating النوى معزولة عن جسيمات HIV – 1 المعدية. هذا النهج ينطوي على عزل النوى بالترسيب من خلال virions تتركز طبقة من المنظفات والى الانحدار الخطي السكروز ، في البرد. لتحديد uncoating ، يتم تحضين النوى معزولة عند 37 درجة مئوية لفترات مختلفة وتوقيتها لاحقا من قبل مكعبات تنبيذ فائق. ويتم تحليل مدى uncoating عن طريق قياس نسبة ضئيلة من CA في طاف. وقد استخدمت هذه الطريقة لتحليل آثار الطفرات الفيروسية على HIV – 1 الاستقرار قفيصة 4 ، 5 ، 6. وينبغي أن يكون من المفيد أيضا لدراسة دور العوامل الخلوية في HIV – 1 uncoating.
Protocol
Discussion
وصف الأسلوب هنا لتنقية HIV – 1 النوى لدراسة uncoating في المختبر هو مفيد لدراسة هذه المرحلة من دورة الحياة HIV – 1 ، خصوصا بسبب عدم وجود طريقة لتحليل التحقق من صحة HIV – 1 uncoating في الخلايا المستهدفة. على الرغم من أن هذا الأسلوب يستخدم لتنقية تنبيذ فائق التوازن النوى ، والبعض الآخر ق…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HIV – 1 ودعمت دراسات uncoating في المختبر أيكن من منح المعاهد الوطنية للصحة AI40364 ، وAI50423 AI076121. وقدمت العديد من المواد الأساسية ، بما في ذلك الكواشف المستخدمة في ELISA P24 ، من قبل المعاهد الوطنية للصحة لأبحاث الايدز والبرنامج المرجعي ، شعبة الإيدز ، NIAID ، المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
3957 | |
|
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 |
References
- Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core. Science. 283, 80-83 (1999).
- Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein. Nature. 407, 409-413 (2000).
- Aiken, C. Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating. Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).
- Forshey, B. M., Schwedler, U. v. o. n., Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).
- Forshey, B. M., Aiken, C. Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex. J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).
- Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating. Virology. 358, 48-54 (2007).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Aiken, C., Prasad, V. R., Ganjam, K. V. . Methods in Molecular Biology. 485, 41-53 (2009).
- Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core. J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).
- Kewalramani, V. N., Emerman, M. Vpx association with mature core structures of HIV-2. Virology. 218, 159-168 (1996).
- Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12, 288-293 (1997).
- Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kräusslich, H. G. Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).
- Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kräusslich, H. G., Fuller, S. D. Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores. EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).
- Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. Uncoating of HIV-1 requires cellular activation. Virology. 337, 93-101 (2005).
- Accola, M. A., Ohagen, A., Göttlinger, H. G. Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag. J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).
