Imaging neuronalen Antworten in Scheiben Zubereitungen von Vomeronasalorgan Ausdruck eines genetisch kodierte Kalzium-Sensor
Summary
Die Vomeronasalorgan (VNO) erkennt Intraspezies chemischen Signalen, die sozialen und reproduktiven Informationen zu vermitteln. Wir haben Ca2 +-Imaging durchgeführt Experimente mit transgenen Mäusen, die G-camp2 in VNO Gewebe. Dieser Ansatz erlaubt es uns, die komplizierten Reaktionsmuster des vomeronasalen Neuronen eine große Anzahl von Pheromon-Stimuli zu analysieren.
Abstract
Die Vomeronasalorgan (VNO) erkennt chemosensorischen Signale, die Informationen über die sozialen, sexuellen und reproduktiven Status der Individuen innerhalb der gleichen Spezies 1,2 tragen. Diese innerartliche Signale, die Pheromone, sowie Signale von einigen Räubern 3, aktivieren Sie die vomeronasalen sensorischen Neuronen (VSNs) mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit 4. Mindestens drei verschiedene Familien von G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, V1R, V2R und FPR 5-14, sind in VNO Neuronen exprimiert, um den Nachweis der chemosensorischen Cues zu vermitteln. Um zu verstehen, wie Pheromone Informationen des VNO codiert ist, ist es entscheidend, um die Antwort Profile einzelner VSNs auf verschiedene Reize zu analysieren und die spezifischen Rezeptoren, die diese Reaktionen zu vermitteln.
Die neuroepithelia des VNO sind in ein Paar Vomer Knochen umschlossen. Die halb-blind röhrenförmige Struktur des VNO hat ein offenes Ende (das vomeronasale Kanal) eine Verbindung zuder Nasenhöhle. VSNs erweitern ihre Dendriten zum Lumen Teil des VNO, wo die Pheromon-Signale sind in Kontakt mit den Rezeptoren auf der dendritischen Knöpfen zum Ausdruck gebracht. Die Zellkörper der VSNs Form pseudo-geschichteten Lagen mit V1R und V2R in den apikalen und basalen Schichten jeweils 6-8 ausgedrückt. Verschiedene Techniken wurden verwendet, um Antworten VSNs auf Sinnesreize 4,12,15-19 überwachen. Unter diesen Techniken bietet akuten Scheibe Vorbereitung mehrere Vorteile. Erstens, im Vergleich zu trennen VSNs 3,17 pflegen Scheibe Vorbereitungen der Neuronen in ihrem nativen Morphologie und die Dendriten der Zellen bleiben relativ intakt. Zweitens sind die Zellkörper der VSNs leicht zugänglich in koronare Schicht des VNO zu elektrophysiologischen Studien-und Imaging-Experimente ermöglichen, um die ganze Epithel-und Ganzkörper-Mount-Präparaten 12,20 verglichen. Drittens kann diese Methode mit molekularen Klonierungstechniken kombiniert werden, um Rezeptor-Identifizierung zu ermöglichen.
Sensorische Stimulation löst starke Ca 2 +-Einstrom in VSNs, die indikativ für Rezeptor-Aktivierung 4,21 ist. Wir entwickeln so transgene Mäuse, die zum Ausdruck G-camp2 in den Riechzellen, einschließlich der VSNs 15,22. Die Empfindlichkeit und der genetischen Beschaffenheit der Sonde erheblich erleichtern Ca 2 +-Imaging Experimente. Diese Methode hat den Farbstoff Ladevorgang in früheren Studien 4,21 verwendet eliminiert. Darüber hinaus setzen wir ein Ligand Delivery System, Anwendung verschiedener Reize ermöglicht, die VNO Scheiben schneiden. Die Kombination der beiden Techniken ermöglicht es uns, mehrere Neurone gleichzeitig überwachen in Reaktion auf eine große Anzahl von Reizen. Schließlich haben wir eine semi-automatisierte Analyse-Pipeline für die Bildverarbeitung unterstützen soll.
Protocol
Discussion
Die Mehrheit der vomeronasalen Rezeptoren (VRS) bleiben als Orphan-Rezeptoren seit ihrer Entdeckung durch Dulac und Axel 5. Die Pheromon-Liganden für diese Chemosensoren und ihre Rollen bei der Vermittlung von Tieren Verhaltensweisen sind nicht gut verstanden. Bis jetzt hat nur ein Paar von Ligand / Rezeptor, der ESP1 Peptid und seinem verwandten Rezeptor, Vmn2r116 (V2Rp5), wurden identifiziert und gezeigt, dass bestimmte soziale Informationen 19,23 vermitteln. Ein weiterer Rezeptor, V1rb2, hat si…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Andrea Moran zusammen mit Mitgliedern der Lab Tier-Service Facility (LaSF) bei Stowers Institute für ihre hervorragende Unterstützung bei der Tierhaltung und technische Dienstleistungen. Diese Arbeit wird durch Mittel aus Stowers Institute und die NIH (NIDCD 008003) zu CRY unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Institute on Taubheit und andere Kommunikationsstörungen oder die National Institutes of Health. US patent pending für die tetO-G-camp2 Mäuse für Stowers Institute, CRY und LM.
References
- Birch, M. C. . Pheromones. , (1974).
- Wyatt, T. D. Pheromones and animal behaviour : communication by smell and taste. , (2003).
- Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs. Cell. 141, 692-703 (2010).
- Leinders-Zufall, T. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
- Dulac, C., Axel, R. A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals. Cell. 83, 195-206 (1995).
- Herrada, G., Dulac, C. A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution. Cell. 90, 763-773 (1997).
- Matsunami, H., Buck, L. B. A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals. Cell. 90, 775-784 (1997).
- Ryba, N. J., Tirindelli, R. A new multigene family of putative pheromone receptors. Neuron. 19, 371-379 (1997).
- Pantages, E., Dulac, C. A novel family of candidate pheromone receptors in mammals. Neuron. 28, 835-845 (2000).
- Zhang, X., Rodriguez, I., Mombaerts, P., Firestein, S. Odorant and vomeronasal receptor genes in two mouse genome assemblies. Genomics. 83, 802-811 (2004).
- Liberles, S. D. Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).
- Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
- Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats. Genomics. 86, 306-315 (2005).
- Rodriguez, I., Punta, D. e. l., Rothman, K., Ishii, A., T, ., Mombaerts, P. Multiple new and isolated families within the mouse superfamily of V1r vomeronasal receptors. Nat. Neurosci. 5, 134-140 (2002).
- He, J., Ma, L., Kim, S., Nakai, J., Yu, C. R. Encoding gender and individual information in the mouse vomeronasal organ. Science. 320, 535-538 (2008).
- Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli. Science. 289, 1569-1572 (2000).
- Chamero, P. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450, 899-902 (2007).
- Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).
- Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437, 898-901 (2005).
- Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy. Neuron. 57, 661-672 (2008).
- Leinders-Zufall, T. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306, 1033-1037 (2004).
- He, J. Distinct signals conveyed by pheromone concentrations to the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 30, 7473-7483 (2010).
- Haga, S. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466, 118-122 (2010).
- Boschat, C. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5, 1261-1262 (2002).
- Hendel, T. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in. 28, 7399-7411 (2008).
- Pologruto, T. A., Yasuda, R., Svoboda, K. Monitoring neural activity and [Ca2+] with genetically encoded Ca2+ indicators. J. Neurosci. 24, 9572-9579 (2004).
- Jayaraman, V., Laurent, G. Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies. Front Neural Circuits. 1 (3), (2007).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
