달걀 주위에 계란과 세포외 코팅 자주 정자와 통신이이를 수정을 홍보 계란 그들을 안내하는 것을 펩티드, 단백질, 작은 분자를 놓습니다. 정자의 누적 assays와 정자 추적 assays - 우리가 정자 chemoattraction를 감지하는 데 사용되는 assays 두 가지 클래스를 설명하고 비교 개구리 정자를 사용하여.
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이 논문에서
요약
초록
무척추 동물의 정자 chemoattraction 하나는 정자 서스펜션에 매력적인 펩티드를 포함하는 피펫을 배치하고 미세 피펫 1 시경 정자 축적을 시각화 수있는 충분한 강력한하실 수 있습니다. 같은 개구리, 설치류 동물과 인간과 같은 척추 동물의 정자 chemoattraction 감지하기가 더 어렵습하고 양적 assays가 필요합니다. chemoattractant의 소스, 이른바 정자의 누적 assays, 실제로 개별적인 정자의 수영 궤도를 추적 assays하기 위해 정자의 움직임을 quantitate assays - 이러한 assays는 크게 두 가지 유형의 수 있습니다.
정자의 누적 assays하므로 선량 반응 곡선 및 시간 코스가 상대적으로 빠르게 진행 될 수 있도록 비교적 빠른 있도록 수십 또는 하루에 할 수 assays 수백 있습니다. assays 이러한 종류의 많은 잘 설립 chemoattraction 시스템을 특성화하기 위해 광범위하게 사용되었습니다 - BAC에 예를 들어, 호중구은 chemotaxisfollicular 유체에 terial 펩티드와 정자의 chemotaxis. 정자 추적 assays 집중보다 노동 수 있지만 chemoattractancts 실제로 정자가 들어있는 수영장 경로를 변경 방법에 대한 자세한 데이터를 제공할 수 있습니다. 분석의이 유형은 chemoattrractant 그라데이션 축에 비해 정자 운동의 방향을 설명하고 특성을 전환하거나 달걀에 가깝게 정자를 가지고 방향의 변화를 시각화하기 위해 필요합니다.
여기 assays 이러한 두 가지 유형의 각각의 사용 방법을 설명합니다. 활용 정자 축적 분석은 "두 챔버"분석이라고합니다. 수륙 양용의 정자는 12 μm의 직경의 모공을 가진 폴리 카보 네이트 필터 층과 조직 문화 플레이트 삽입에 배치됩니다. 정자와 삽입물은 버퍼와 신중하게 바닥이 벽을 (그림을 참조하십시오. 1) '요건을 충족하고 잘 하단에 pipetted chemoatttractant를 포함하는 조직 문화 판 우물에 게재됩니다. 부화 후, 정자 저수지를 포함하는 상위 삽입은 신중하게 r이된다막 통과가 아래쪽 챔버에 emoved, 그리고 정자가 제거 pelleted 후 hemocytometer 또는 흐름 cytometer로 계산됩니다.
정자 추적 분석은 원래 호중구의 chemotaxis을 준수를위한 개발 Giojalas 동료 2,3에 의해 정자의 관찰에 대한 수정 Zigmond 챔버를 사용합니다. 챔버는 두 세로 골짜기가 가공되어이있는에 두꺼운 유리 슬라이드로 구성되어 있습니다. 이들은 1mm 폭 전망대로 구분됩니다. 커버 유리, 정자의 응용 프로그램을 하나의 구유에로드되고 나면, 개별 정자의 다른과 운동으로 chemoattractant 에이전트 비디오 현미경에 의해 시각. 비디오 영상은 다음 각 정자의 궤도를 형성 시간 (xyt 데이터 세트)의 함수로 XY 평면에 2 차원 세포 움직임을 파악하는 소프트웨어를 사용하여 분석합니다.
프로토콜
1. 재료 및 사용된 버퍼
- Oocyte에 울리는의 버퍼 (1.5 X OR2)는 124 MM NaCl, 3.75 MM KCl, 1.5 MM CaCl 2, MgCl 2 1.5 MM 1.5 MM 나 2 HPO 4, 10 MM Hepes를 포함 산도 7.8. 수정 버퍼 (F - 1)은 41.25 MM NaCl, 1.25 MM KCl, 0.25 MM CaCl 2, 0.06 MM MgCl 2, 0.5 MM 나 2 HPO 4, 2.5 MM Hepes, 산도 7.8이 포함되어 있습니다.
- Xenopus laevis 계란 물을 스기야마 외에 따라 준비가되어 있습니다. 4. 간단히 설명, 갓 양산 젤리 개구리 알을 30 분 micropipette에 의해 제거 에어컨 매체에 F - 1 버퍼의 작은 볼륨에서 swirled 있습니다. "계란 물"을 칭했다이 매체는 또한 정제된 allurin이 젤리 추출물의 기본 chemoattractant를 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 정자는 상업 자란 Xenopus laevis 또는 Xeno....
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토론
amoeboid 운동이나 flagella 구동 수영에 의해 움직이는 세포의 Chemotaxis은 많은 생물 학적 문맥에서 발견하고이 현상의 연구는 실용적이고 안정적인 assays의 가용성을해야합니다. 이러한 성게 계란이나 fruiting기구를 형성 점액 금형 세포의 모임에 정자의 매력으로 현상의 몇 가지 예입니다, 즉각적인 시각적 영향을 미칠. 이러한 현상의 Quantitation는 Eisenbach 18에서 설명한대로 다양한 방법으로 수행되었습니다. 이러한 assays는 모세 혈관은 Makler 챔버는 정자와 chemoattractant에 대한 우물을 가질 그라디언트 및 사용을 만들 저수지에 가입 모세 혈관을 사용 정자를 유치 가득 chemoattractant의 사용을 포함합니다. 본 논문은 이제 더 자주 사용되는 두 개의 "2 세대"assays을 설명합니다. 이러한 assays 아직도 그들은 여러 가지 새로운 기능을 통합 그라디언트를 만들 필요가에 의존하지만. 첫째, 두 챔버 분석은.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 그들의 비디오 현미경 작업 스테이션의 사용을 위해 WM 중사님의 Bioimaging 연구소 주셔서 감사합니다. 이 연구는 NSF 부여 이븐 - 0,615,435에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 항목의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| 24 잘 접시 | Becton - Dickenson | 1,147분의 35 | |
| 12 μm의 기공 멤브레인와 12mm 외경 삽입 | Millipore | PIXP01250 | 우리는 이전에 Costar - 코닝 transwell 플레이트 # 3403 - 지금은 중단하는데 |
| Zigmond 챔버 | Neuroprobe | Z02 | |
| 실리콘 오일 | 제너럴 일렉트릭 | SF1154 | 다우 코닝 550의 유체에 해당 |
| 이미지 J 소프트웨어 | 웨인 Rasband, 연구 서비스 지점, 정신 건강의 국립 연구소 | 에서 무료 다운로드 http://rsbweb.nih.gov/ij | 윈도우 린에서 실행되는 자바 프로그램UX 및 Mac |
| MtrackJ 소프트웨어 | 에릭 Meijering / Imagescience / 바이오 메디컬 이미징 그룹 , Erasmus MC - 대학 의료 센터 로테르담 | 사이트에서 무료로 다운로드할 http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ | 윈도우, 리눅스 및 Mac에서 실행되는 자바 프로그램 |
| 가상 재녹음 소프트웨어 | GNU 일반 공중 라이센스 소프트웨어 | 를 통해 무료 다운로드 http://www.virtualdub.org/index.html | 플러그인에서 이미지 J 웹사이트에서 설치 지침, 전용 Windows 용 |
| cellSens 소프트웨어 | 올림포스 산 | : 홈페이지 참조 http://www.olympusamerica.com/seg_section/p을roduct.asp? 제품 = 1,070 | 컨트롤 및 카메라의 다양한 이미지를 얻습니다. 또한 이미지 처리 능력을 가지고 |
참고문헌
- Ward, G. E., Brokaw, C. J., Garbers, D. L., Vacquier, V. D. Chemotaxis of Arbacia punctulata spermatozoa to resact, a peptide from the egg jelly layer. J. Cell Biol. 101, 2324-2329 (1985).
- Olivera, R. G., Tomasi, L., Rovasio, R. A., Giojalas, L. C.
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재인쇄 및 허가
