Overvågning kinase og fosfatasesæt aktiviteter gennem cellecyklus ved Ratiometrisk FRET
Summary
FRET-baserede journalister i stigende grad anvendes til at overvåge kinase og fosfatase aktiviteter i levende celler. Her beskriver vi en metode til, hvordan du bruger FRET-baserede journalister til at vurdere cellecyklus-afhængige ændringer i mål fosforylering.
Abstract
Förster resonans energi overførsel (FRET)-baseret reportere 1 tager højde for vurderingen af endogene kinase og fosfatase aktiviteter i levende celler. Sådanne sonder består typisk af varianter af den fælles fiskeripolitik og YFP, intervenerede ved en phosphorylatable sekvens og en fosfor-bindende domæne. Efter fosforylering, FRET sonden ændringer kropsbygning, hvilket resulterer i en ændring af den afstand eller orientering mellem den fælles fiskeripolitik og YFP, hvilket fører til en ændring i effektivitet (figur 1). Flere sonder er blevet offentliggjort i det seneste årti, at overvåge aktiviteten balance af flere kinaser og fosfataser, herunder indberettere af PKA 2, PKB 3, PKC 4, PKD 5, ERK 6, JNK 7, CDK 18, Aurora B 9 og Plk1 9 . I betragtning af den modulære design, er yderligere sonder sandsynligvis opstå i den nærmeste fremtid 10.
Progression gennem cellecyklus er ramt af stress signaling veje 11. Især er cellecyklus reguleret forskelligt under uforstyrrede vækst i forhold til, når cellerne er ved at komme fra stress 12. Time-lapse billeder af celler gennem cellecyklus derfor kræver særlig forsigtighed. Dette bliver et problem, især ved ansættelse af ratiometrisk billedbehandling, da to billeder med en høj signal støjforhold er forpligtet til at fortolke resultaterne. Ratiometrisk FRET billeddannelse af cellecyklus afhængige ændringer i kinase og phosphatase aktiviteter har overvejende været begrænset til sub-sektioner af cellecyklus 8,9,13,14.
Her diskuterer vi en metode til at overvåge FRET-baserede prober bruger ratiometrisk billeddannelse i hele den menneskelige cellecyklus. Metoden bygger på udstyr, der er til rådighed for mange forskere inden for biovidenskab og kræver ikke ekspertviden af mikroskopi eller billedbehandling.
Protocol
Discussion
Overvågning FRET hele cellecyklus kræver overvejelser, der er mindre afgørende ved vurderingen af kortfristede reaktioner på eksterne stimuli. Først er cellecyklus progression nemt forstyrres af stress signalering, der kræver, at fototoksicitet holdes på et minimum. For det andet kan alle journalister potentielt påvirke cellulære processer ved titrering ud kinaser, fosfataser eller interaktion domæner. Den nok mest ligefremme måde at vurdere, om de eksperimentelle betingelser er passende, er, at måle c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er støttet af den svenske forskningsråd, det svenske grundlaget for strategisk forskning, den svenske Kræftens Bekæmpelse, den svenske barnet Kræftens Bekæmpelse, Åke WIBERGS fundament og Jeanssons fundament.
Materials
| Reagent | Catalogue Number | Company |
| Leibovitz L-15, no phenol red | 21083-027 | GIBCO, by Life Technologies |
| DMEM+Glutamax-I | 31966 | GIBCO, by Life Technologies |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SV30160.03 | HyClone |
| 0.05% Trypsin EDTA | SH30236.01 | HyClone |
| Penicillin-Streptomycin | SV30010 | HyClone |
| DPBS | 14287 | GIBCO, by Life Technologies |
| Puromycin | P8833 | Sigma-Aldrich |
References
- Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth. Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).
- Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter. J. Biol. Chem. 280, (2005).
- Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).
- Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter. Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).
- Harvey, C. D. A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).
- Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).
- Gavet, O., Pines, J. Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis. Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).
- Fuller, B. G. Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient. Nature. 453, 1132-1136 (2008).
- Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters. Methods. 40, 279-286 .
- Morgan, D. O. . The cell cycle : principles of control. , (2007).
- Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network. J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).
- Macurek, L. Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery. Nature. 455, 119-123 (2008).
- van der Eb, A. J., Graham, F. L. Assay of transforming activity of tumor virus DNA. Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).
- Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis. Biotechniques. 42, 71-75 (2007).
- Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry–approaches and a software solution. Cytometry A. 75, 761-767 (2009).
