Overvåking Kinase og fosfatase Aktiviteter Gjennom Cell Cycle av Ratiometric FRET
Summary
FRET-baserte journalister blir stadig mer brukt til å overvåke kinase og fosfatase aktiviteter i levende celler. Her beskriver vi en metode om hvordan du bruker FRET-baserte journalister å vurdere celle syklus-avhengige endringer i mål fosforylering.
Abstract
Förster resonans energi overføring (FRET)-baserte journalister en tillate vurdering av endogene kinase og fosfatase aktiviteter i levende celler. Slike prober typisk bestå av varianter av CFP og YFP, grepet av en phosphorylatable sekvens og en fosfor-bindende domene. Ved fosforylering, sonden endringene konformasjon, som resulterer i en endring av avstand eller retning mellom CFP og YFP, fører til en endring i FRET effektivitet (fig 1). Flere sonder har blitt publisert i løpet av det siste tiåret, overvåke aktiviteten balansen av flere kinaser og fosfataser, inkludert journalister på 2 PKA, 3 PKB, 4 PKC, 5 PKD, 6 ERK, 7 JNK, 18 CDK, Aurora B 9 og Plk1 9 . Gitt den modulære design, flere prober er sannsynlig å dukke opp i nær fremtid 10.
Progresjon gjennom cellesyklus er påvirket av stress signaling veier 11. Spesielt er cellesyklus reguleres annerledes under uforstyrret vekst i forhold til når cellene er utvinne fra stress 12. Time-lapse avbildning av celler gjennom cellesyklus krever derfor spesiell forsiktighet. Dette blir et problem spesielt ved ansettelse ratiometric imaging, siden to bilder med høyt signal til støyforhold er nødvendig for å tolke resultatene. Ratiometric FRET avbildning av cellesyklus avhengige endringer i kinase og fosfatase aktiviteter har hovedsakelig vært begrenset til sub-seksjoner av cellesyklus 8,9,13,14.
Her diskuterer vi en metode for å overvåke FRET-baserte sondene bruker ratiometric bildebehandling hele den menneskelige cellesyklus. Metoden baserer seg på utstyr som er tilgjengelig for mange forskere i life sciences og krever ikke ekspertkunnskap om mikroskopi eller bildebehandling.
Protocol
Discussion
Overvåking FRET gjennom cellesyklus krever hensyn som er mindre avgjørende ved vurderingen av kortsiktig respons på ytre stimuli. Først er cellesyklus progresjon lett opprørt av stress-signalering, som krever at fototoksisitet holdes til et minimum. Sekund, kan alle reportere potensielt påvirke cellulære prosesser ved titrering ut kinaser, fosfataser eller interaksjon domener. Den sannsynligvis enkleste måten å vurdere om den eksperimentelle forholdene er tilstrekkelige, er å måle cellen syklus lengde fra mit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er støttet av det svenske forskningsrådet, den svenske Stiftelsen for strategisk forskning, den svenske kreft samfunnet, svenske barn Kreftforeningen, Åke Wibergs fundament og Jeanssons fundament.
Materials
| Reagent | Catalogue Number | Company |
| Leibovitz L-15, no phenol red | 21083-027 | GIBCO, by Life Technologies |
| DMEM+Glutamax-I | 31966 | GIBCO, by Life Technologies |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SV30160.03 | HyClone |
| 0.05% Trypsin EDTA | SH30236.01 | HyClone |
| Penicillin-Streptomycin | SV30010 | HyClone |
| DPBS | 14287 | GIBCO, by Life Technologies |
| Puromycin | P8833 | Sigma-Aldrich |
References
- Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth. Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).
- Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter. J. Biol. Chem. 280, (2005).
- Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).
- Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter. Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).
- Harvey, C. D. A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).
- Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).
- Gavet, O., Pines, J. Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis. Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).
- Fuller, B. G. Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient. Nature. 453, 1132-1136 (2008).
- Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters. Methods. 40, 279-286 .
- Morgan, D. O. . The cell cycle : principles of control. , (2007).
- Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network. J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).
- Macurek, L. Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery. Nature. 455, 119-123 (2008).
- van der Eb, A. J., Graham, F. L. Assay of transforming activity of tumor virus DNA. Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).
- Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis. Biotechniques. 42, 71-75 (2007).
- Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry–approaches and a software solution. Cytometry A. 75, 761-767 (2009).
