اختيار وعزل المستعمرات من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة برمجتها من الخلايا الليفية الكبار
Summary
نقدم لبروتوكول لإعادة برمجة الخلايا الجسدية من كفاءة الإنسان في صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSC) باستخدام نواقل فيروس ترميز Oct3 / 4، Sox2، Klf4 و C-myc (OSKM) وتحديد hiPSC برمجتها بشكل صحيح عن طريق تلطيخ على الهواء مباشرة مع هيئة تنظيم الاتصالات 1-81 الأجسام المضادة.
Abstract
هنا نطرح على بروتوكول إعادة برمجة الخلايا الليفية بالغ الإنسان في صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSC) باستخدام نواقل فيروس ترميز Oct3 / 4، Sox2، Klf4 و C-myc (OSKM) في وجود الزبدات الصوديوم 1-3. استخدمنا هذه الطريقة لإعادة برمجة مرور في وقت متأخر (> P10) الليفية الكبار حقوق الإنسان مستمد من المريض رنح فريدريك (GM03665، Coriell مستودع). نهج إعادة برمجة وتشمل كفاءة عالية باستخدام بروتوكول تنبيغ الطرد المركزي المتكررة من الخلايا الليفية في حضور وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروس. وقد تم تحديد المستعمرات hiPSC برمجتها باستخدام المناعية الحية لترا-81-1، علامة سطح الخلايا المحفزة، وفصلها عن الخلايا الليفية غير برمجتها وpassaged 4،5 يدويا. ثم تم نقل هذه hiPSC لوحات Matrigel ونمت في ظروف التغذية، مجانا، مباشرة من لوحة إعادة برمجة. ابتداء من المقطع الاول، المستعمرات hiPSC شرح الخصائص HES-Lآيك التشكل. ويمكن استخدام هذا البروتوكول أن أكثر من 70٪ من المستعمرات المختارة بنجاح موسع، وأنشأ في خطوط الخلايا. عرض خطوط أنشئت hiPSC علامات تعدد القدرات المميزة بما في ذلك علامات سطح TRA-1-60 و SSEA-4، فضلا عن علامات النووية Oct3 / 4، وSox2 Nanog. تم تأسيس بروتوكول المقدمة هنا واختبار باستخدام الخلايا الليفية الكبار التي تم الحصول عليها من المرضى رنح فريدريك والأفراد سيطرة 6، الليفية الوليد الإنسان، فضلا عن الخلايا الكيراتينية البشرية.
Protocol
Discussion
دراسة الأمراض التي تصيب الإنسان، والجهاز العصبي وخاصة الاعصاب، وقد تم الطعن على نحو خاص بسبب عدم إمكانية الوصول إلى نماذج كافية الخلوية الإنسان. افتتح والقدرة على إعادة برمجة الخلايا الجسدية التي يمكن الحصول عليها بسهولة في الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها وإمك…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل تحالف فريدريك البحث رنح ومنحة رائدة من أرنولد العائلة المؤسسة ومركز الخلايا الجذعية وعلم الأحياء التنموي في مركز اندرسون للسرطان.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number |
| DMEM | Invitrogen | 11965 |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 |
| KSR | Invitrogen | 10828 |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 |
| Sodium butyrate | Sigma | B5887 |
| Y27632 | Stemgent | 04-0012 |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 |
| Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 |
| Oct3/4 antibody | Santa Cruz | sc-8628 |
| Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S |
| Tra-1-60 antibody | Millipore | MAB4360 |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S |
| SSEA4 | Millipore | MAB4304 |
| CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G |
| Objective marker | Nikon | MBW10010 |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 05850 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 |
| Fugene 6 | Roche | 11814443001 |
| polybrene | Sigma | H9268 |
| Object marker | Nikon | MBW10010 |
References
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mali, P., Chou, B. K., Yen, J., Ye, Z., Zou, J., Dowey, S., Brodsky, R. A., Ohm, J. E., Yu, W., Baylin, S. B., Yusa, K., Bradley, A., Meyers, D. J., Mukherjee, C., Cole, P. A., Cheng, L. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 28, 713-720 (2011).
- Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B. E., Jaenisch, R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., Pyle, A. D., Tchieu, J., Sridharan, R., Clark, A. T., Plath, K. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Dick, E., Matsa, E., Bispham, J., Reza, M., Guglieri, M., Staniforth, A., Watson, S., Kumari, R., Lochmuller, H., Young, L., Darling, D., Denning, C. Two new protocols to enhance the production and isolation of human induced pluripotent stem cell lines. Stem Cell Res. 6, 158-167 (2011).
- Ku, S., Soragni, E., Campau, E., Thomas, E. A., Altun, G., Laurent, L. C., Loring, J. F., Napierala, M., Gottesfeld, J. M. Friedreich’s ataxia induced pluripotent stem cells model intergenerational GAATTC triplet repeat instability. Cell Stem Cell. 7, 631-637 (2010).
- Emre, N., Vidal, J. G., Elia, J., O’Connor, E. D., Paramban, R. I., Hefferan, M. P., Navarro, R., Goldberg, D. S., Varki, N. M., Marsala, M., Carson, C. T. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5, e12148-e12148 (2011).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).
- Yu, J., Thomson, J. A., Lanza, R. Induced Pluripotent Stem Cell Derivation. Essentials of Stem Cell Biology. , 331-337 (2009).
- Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thomson, J. A. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Woltjen, K., Michael, I. P., Mohseni, P., Desai, R., Mileikovsky, M., Hamalainen, R., Cowling, R., Wang, W., Liu, P., Gertsenstein, M., Kaji, K., Sung, H. K., Nagy, A. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A., Daley, G. Q., Brack, A. S., Collins, J. J., Cowan, C., Schlaeger, T. M., Rossi, D. J. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
- Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R., Kim, K. S. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Han, S. S., Williams, L. A., Eggan, K. C. Constructing and deconstructing stem cell models of neurological disease. Neuron. 70, 626-644 (2011).
