Vi præsenterer en protokol til effektiv omprogrammering af humane somatiske celler i menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) ved hjælp af retrovirale vektorer koder Oct3 / 4, Sox2, Klf4 og c-myc (OSKM) og identifikation af korrekt omprogrammeres hiPSC af levende farvning med Tra- 1-81 antistof.
Heri præsenterer vi en protokol omprogrammering humane voksne fibroblaster i humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) under anvendelse af retrovirale vektorer, der koder Oct3 / 4, Sox2, Klf4 og c-myc (OSKM) i nærvær af natriumbutyrat 1-3. Vi har brugt denne metode til at omprogrammere sent passage (> P10) humane voksne fibroblaster afledt af Friedreichs ataksi patient (GM03665, Coriell Repository). Omprogrammering fremgangsmåde omfatter højeffektive transduktion protokol under anvendelse gentagen centrifugering af fibroblaster i nærværelse af virus-holdige medier. De omprogrammerede hiPSC kolonier blev identificeret ved hjælp af levende immunfarvning for Tra-1-81 en overflademarkør af pluripotente celler, adskilt fra ikke-omprogrammerede fibroblaster og manuelt passeret 4,5. Disse hiPSC blev derefter overført til Matrigel plader og dyrket i feeder-frie betingelser, direkte fra omprogrammering pladen. Startende fra den første passage, hiPSC kolonier viser karakteristiske HES-lIKE morfologi. Anvendelse af denne protokol mere end 70% af udvalgte kolonier med held kan udvides og etableret i cellelinier. De etablerede hiPSC linier viste karakteristiske pluripotens markører, herunder overflademarkører TRA-1-60 og SSEA-4, såvel som nukleare markører Oct3 / 4, Sox2 og Nanog. Protokollen præsenteres her er blevet etableret og testet ved hjælp af voksne fibroblaster opnået fra Friedreichs ataksi patienter og kontrolpersoner personer 6, menneskelige nyfødte fibroblaster, såvel som humane keratinocytter.
Forskning i menneskers sygdomme, især neurologiske og neurodegenerative, er blevet en særlig stor udfordring på grund af den manglende adgang til passende menneskelige cellulære modeller. Evnen til at omprogrammere let kan opnås somatiske celler i inducerede pluripotente stamceller og muligheden for at differentiere dem til forskellige celletyper åbnet en mulighed for at skabe cellulære modeller af genetiske sygdomme. Hertil kommer, at holde IPSC'er et stort løfte i fremtiden for regenerativ medicin. Derfor …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Friedreichs ataksi Research Alliance og en pilot tilskud fra Arnold Family Foundation og The Center for Stamceller og udviklingsmæssige biologi på MD Anderson Cancer Center.
Reagent | Company | Catalog number |
DMEM | Invitrogen | 11965 |
DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 |
KSR | Invitrogen | 10828 |
Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 |
Sodium butyrate | Sigma | B5887 |
Y27632 | Stemgent | 04-0012 |
bFGF | Stemgent | 03-0002 |
Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 |
Oct3/4 antibody | Santa Cruz | sc-8628 |
Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S |
Tra-1-60 antibody | Millipore | MAB4360 |
Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S |
SSEA4 | Millipore | MAB4304 |
CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G |
Objective marker | Nikon | MBW10010 |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 05850 |
β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 |
Fugene 6 | Roche | 11814443001 |
polybrene | Sigma | H9268 |
Object marker | Nikon | MBW10010 |