Selektion og isolering Kolonier af Human induceret pluripotente stamceller omprogrammeret fra voksne fibroblaster
Summary
Vi præsenterer en protokol til effektiv omprogrammering af humane somatiske celler i menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) ved hjælp af retrovirale vektorer koder Oct3 / 4, Sox2, Klf4 og c-myc (OSKM) og identifikation af korrekt omprogrammeres hiPSC af levende farvning med Tra- 1-81 antistof.
Abstract
Heri præsenterer vi en protokol omprogrammering humane voksne fibroblaster i humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) under anvendelse af retrovirale vektorer, der koder Oct3 / 4, Sox2, Klf4 og c-myc (OSKM) i nærvær af natriumbutyrat 1-3. Vi har brugt denne metode til at omprogrammere sent passage (> P10) humane voksne fibroblaster afledt af Friedreichs ataksi patient (GM03665, Coriell Repository). Omprogrammering fremgangsmåde omfatter højeffektive transduktion protokol under anvendelse gentagen centrifugering af fibroblaster i nærværelse af virus-holdige medier. De omprogrammerede hiPSC kolonier blev identificeret ved hjælp af levende immunfarvning for Tra-1-81 en overflademarkør af pluripotente celler, adskilt fra ikke-omprogrammerede fibroblaster og manuelt passeret 4,5. Disse hiPSC blev derefter overført til Matrigel plader og dyrket i feeder-frie betingelser, direkte fra omprogrammering pladen. Startende fra den første passage, hiPSC kolonier viser karakteristiske HES-lIKE morfologi. Anvendelse af denne protokol mere end 70% af udvalgte kolonier med held kan udvides og etableret i cellelinier. De etablerede hiPSC linier viste karakteristiske pluripotens markører, herunder overflademarkører TRA-1-60 og SSEA-4, såvel som nukleare markører Oct3 / 4, Sox2 og Nanog. Protokollen præsenteres her er blevet etableret og testet ved hjælp af voksne fibroblaster opnået fra Friedreichs ataksi patienter og kontrolpersoner personer 6, menneskelige nyfødte fibroblaster, såvel som humane keratinocytter.
Protocol
Discussion
Forskning i menneskers sygdomme, især neurologiske og neurodegenerative, er blevet en særlig stor udfordring på grund af den manglende adgang til passende menneskelige cellulære modeller. Evnen til at omprogrammere let kan opnås somatiske celler i inducerede pluripotente stamceller og muligheden for at differentiere dem til forskellige celletyper åbnet en mulighed for at skabe cellulære modeller af genetiske sygdomme. Hertil kommer, at holde IPSC'er et stort løfte i fremtiden for regenerativ medicin. Derfor …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Friedreichs ataksi Research Alliance og en pilot tilskud fra Arnold Family Foundation og The Center for Stamceller og udviklingsmæssige biologi på MD Anderson Cancer Center.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number |
| DMEM | Invitrogen | 11965 |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 |
| KSR | Invitrogen | 10828 |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 |
| Sodium butyrate | Sigma | B5887 |
| Y27632 | Stemgent | 04-0012 |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 |
| Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 |
| Oct3/4 antibody | Santa Cruz | sc-8628 |
| Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S |
| Tra-1-60 antibody | Millipore | MAB4360 |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S |
| SSEA4 | Millipore | MAB4304 |
| CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G |
| Objective marker | Nikon | MBW10010 |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 05850 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 |
| Fugene 6 | Roche | 11814443001 |
| polybrene | Sigma | H9268 |
| Object marker | Nikon | MBW10010 |
References
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mali, P., Chou, B. K., Yen, J., Ye, Z., Zou, J., Dowey, S., Brodsky, R. A., Ohm, J. E., Yu, W., Baylin, S. B., Yusa, K., Bradley, A., Meyers, D. J., Mukherjee, C., Cole, P. A., Cheng, L. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 28, 713-720 (2011).
- Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B. E., Jaenisch, R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., Pyle, A. D., Tchieu, J., Sridharan, R., Clark, A. T., Plath, K. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Dick, E., Matsa, E., Bispham, J., Reza, M., Guglieri, M., Staniforth, A., Watson, S., Kumari, R., Lochmuller, H., Young, L., Darling, D., Denning, C. Two new protocols to enhance the production and isolation of human induced pluripotent stem cell lines. Stem Cell Res. 6, 158-167 (2011).
- Ku, S., Soragni, E., Campau, E., Thomas, E. A., Altun, G., Laurent, L. C., Loring, J. F., Napierala, M., Gottesfeld, J. M. Friedreich’s ataxia induced pluripotent stem cells model intergenerational GAATTC triplet repeat instability. Cell Stem Cell. 7, 631-637 (2010).
- Emre, N., Vidal, J. G., Elia, J., O’Connor, E. D., Paramban, R. I., Hefferan, M. P., Navarro, R., Goldberg, D. S., Varki, N. M., Marsala, M., Carson, C. T. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5, e12148-e12148 (2011).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).
- Yu, J., Thomson, J. A., Lanza, R. Induced Pluripotent Stem Cell Derivation. Essentials of Stem Cell Biology. , 331-337 (2009).
- Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thomson, J. A. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Woltjen, K., Michael, I. P., Mohseni, P., Desai, R., Mileikovsky, M., Hamalainen, R., Cowling, R., Wang, W., Liu, P., Gertsenstein, M., Kaji, K., Sung, H. K., Nagy, A. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A., Daley, G. Q., Brack, A. S., Collins, J. J., Cowan, C., Schlaeger, T. M., Rossi, D. J. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
- Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R., Kim, K. S. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Han, S. S., Williams, L. A., Eggan, K. C. Constructing and deconstructing stem cell models of neurological disease. Neuron. 70, 626-644 (2011).
