Выбор и изоляция Колонии человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из взрослых Перепрограммированный Фибробласты
Summary
Мы представляем протокол для эффективного перепрограммирования соматических клеток человека в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) с использованием ретровирусных векторов, кодирующих Oct3 / 4, Sox2, Klf4 и с-тус (OSKM) и определение правильно перепрограммировать hiPSC живой окрашивания Тра- 1-81 антител.
Abstract
Здесь мы представляем протокола перепрограммирования фибробластов человека взрослого человека в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC) с использованием ретровирусных векторов, кодирующих Oct3 / 4, Sox2, Klf4 и с-тус (OSKM) в присутствии бутират натрия 1-3. Мы использовали этот метод, чтобы перепрограммировать конце прохода (> p10), человеческие фибробласты взрослого, полученных от пациента атаксия Фридрейха (GM03665, Coriell Repository). Перепрограммирования подход включает в себя высокоэффективный трансдукции протокол, используя повторяющиеся центрифугирования фибробластов в присутствии вируса средах. Перепрограммировать колонии hiPSC были определены с использованием живых иммуногистохимическое TRA-1-81, поверхность маркера плюрипотентных клеток, отделенных от не-перепрограммировать фибробласты и вручную пассировать 4,5. Эти hiPSC затем были переданы Матригель пластин и вырос в питатель без условий, непосредственно от перепрограммирования пластины. Начиная с первого прохода, hiPSC колонии демонстрируют характерный ГЭС-лАйк морфологии. Используя этот протокол более 70% выбранных колоний может быть успешно расширили и установили в клеточных линиях. Установленные hiPSC отображаемых строк характеристика маркеров плюрипотентности включая поверхностные маркеры TRA-1-60 и SSEA-4, а также ядерных маркеров Oct3 / 4, Sox2 и Nanog. Протокол, представленные здесь была создана и протестирована с использованием взрослых фибробластов, полученных от больных атаксией Фридрейха и контроля лиц 6 человек новорожденного фибробластов, а также человеческих кератиноцитов.
Protocol
Discussion
Изучение человеческих болезней, особенно неврологических и нейродегенеративных, была особенно сложной в связи с недоступностью адекватного человека клеточных моделях. Возможность перепрограммировать легко получить соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые кл…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Атаксия Фридрейха Research Alliance и пилот грант Арнольд Family Foundation и Центр стволовых клеток и биологии развития в MD Anderson Cancer Center.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number |
| DMEM | Invitrogen | 11965 |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 |
| KSR | Invitrogen | 10828 |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 |
| Sodium butyrate | Sigma | B5887 |
| Y27632 | Stemgent | 04-0012 |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 |
| Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 |
| Oct3/4 antibody | Santa Cruz | sc-8628 |
| Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S |
| Tra-1-60 antibody | Millipore | MAB4360 |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S |
| SSEA4 | Millipore | MAB4304 |
| CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G |
| Objective marker | Nikon | MBW10010 |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 05850 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 |
| Fugene 6 | Roche | 11814443001 |
| polybrene | Sigma | H9268 |
| Object marker | Nikon | MBW10010 |
References
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mali, P., Chou, B. K., Yen, J., Ye, Z., Zou, J., Dowey, S., Brodsky, R. A., Ohm, J. E., Yu, W., Baylin, S. B., Yusa, K., Bradley, A., Meyers, D. J., Mukherjee, C., Cole, P. A., Cheng, L. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 28, 713-720 (2011).
- Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B. E., Jaenisch, R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., Pyle, A. D., Tchieu, J., Sridharan, R., Clark, A. T., Plath, K. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Dick, E., Matsa, E., Bispham, J., Reza, M., Guglieri, M., Staniforth, A., Watson, S., Kumari, R., Lochmuller, H., Young, L., Darling, D., Denning, C. Two new protocols to enhance the production and isolation of human induced pluripotent stem cell lines. Stem Cell Res. 6, 158-167 (2011).
- Ku, S., Soragni, E., Campau, E., Thomas, E. A., Altun, G., Laurent, L. C., Loring, J. F., Napierala, M., Gottesfeld, J. M. Friedreich’s ataxia induced pluripotent stem cells model intergenerational GAATTC triplet repeat instability. Cell Stem Cell. 7, 631-637 (2010).
- Emre, N., Vidal, J. G., Elia, J., O’Connor, E. D., Paramban, R. I., Hefferan, M. P., Navarro, R., Goldberg, D. S., Varki, N. M., Marsala, M., Carson, C. T. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5, e12148-e12148 (2011).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).
- Yu, J., Thomson, J. A., Lanza, R. Induced Pluripotent Stem Cell Derivation. Essentials of Stem Cell Biology. , 331-337 (2009).
- Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thomson, J. A. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Woltjen, K., Michael, I. P., Mohseni, P., Desai, R., Mileikovsky, M., Hamalainen, R., Cowling, R., Wang, W., Liu, P., Gertsenstein, M., Kaji, K., Sung, H. K., Nagy, A. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A., Daley, G. Q., Brack, A. S., Collins, J. J., Cowan, C., Schlaeger, T. M., Rossi, D. J. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
- Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R., Kim, K. S. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Han, S. S., Williams, L. A., Eggan, K. C. Constructing and deconstructing stem cell models of neurological disease. Neuron. 70, 626-644 (2011).
