İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre seçme ve ayırma Kolonileri Yetişkin Fibroblastlar gelen reprogrammed
Summary
Biz retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ve c-myc (OSKM) kodlayan vektörler ve canlı boyama ile doğru yeniden programlanması hiPSC belirlenmesi kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC) Tra-içine insan somatik hücre verimli yeniden programlama için bir protokol sunmak 1-81 antikor.
Abstract
Burada 1-3 sodyum butirat varlığında Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ve c-myc (OSKM) kodlayan retroviral vektörlerinin kullanılmasıyla insan kaynaklı hücreler pluripotent kök (hiPSC) içine insan yetişkin fibroblastlar yeniden programlanması bir protokol sunulmuştur. Biz geç geçit yeniden programlamak için bu yöntem kullanılır (> p10), FA hasta türetilen insan yetişkin fibroblastları (GM03665, Coriell depo). Yeniden programlanması yaklaşım, virüs içeren ortam varlığında fibroblastlann tekrarlanan santrifüj kullanılarak yüksek verimli transdüksiyon protokolü içerir. Reprogrammed hiPSC koloniler Tra-1-81 canlı immun kullanılarak belirlendi, pluripotent hücreler bir yüzey belirteci olmayan reprogrammed fibroblastlar ayrılır ve elle 4,5 pasajlanmağa. Bunlar daha sonra hiPSC Matrigel plakaları aktarılır ve doğrudan yeniden programlanması plakadan, besleyici içermeyen koşullar içinde büyütülmüştür. Birinci geçit başlayarak, hiPSC koloniler iEK-l karakteristiği gösterilmektedirike morfolojisi. Bu protokolü kullanmak seçilen kolonilerin fazla% 70 başarıyla genişledi ve hücre hatları içine kurulabilir. Kurulan hiPSC hatları yüzey işaretleyicileri TRA-1-60 ve SSEA-4, hem de Nükleer belirteçler Oct3 / 4, Sox2 ve Nanog dahil olmak üzere karakteristik pluripotency belirteçler gösterilmiştir. Burada sunulan protokolü kurulmuş ve Friedreich ataksisi hastalar ve kontrol bireyler 6, insan yenidoğan fibroblastlar, yanı sıra insan keratinositleri elde yetişkin fibroblastlar kullanılarak test edilmiştir.
Protocol
Discussion
Özellikle nörolojik ve nörodejeneratif hastalıkların insan, okuyan, özellikle yeterli insan hücresel modelleri erişilememesi nedeniyle zor olmuştur. Farklı hücre tiplerine bunları ayırt etmek için oluşturulan pluripotent kök hücreleri ve potansiyel kolayca elde edilebilen somatik hücreleri yeniden programlamayı yeteneği genetik hastalıkların hücresel modeller oluşturmak için bir olasılık açtı. Ayrıca, iPSCs rejeneratif tıp gelecekte bir çok ümit vericidir. Bu nedenle, pluripotency için …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma FA Araştırma İttifak ve Arnold Aile Vakfı ve Kök Hücreler ve MD Anderson Kanser Merkezi Gelişimsel Biyoloji Merkezi'nden bir pilot hibe ile desteklendi.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number |
| DMEM | Invitrogen | 11965 |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 |
| KSR | Invitrogen | 10828 |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 |
| Sodium butyrate | Sigma | B5887 |
| Y27632 | Stemgent | 04-0012 |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 |
| Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 |
| Oct3/4 antibody | Santa Cruz | sc-8628 |
| Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S |
| Tra-1-60 antibody | Millipore | MAB4360 |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S |
| SSEA4 | Millipore | MAB4304 |
| CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G |
| Objective marker | Nikon | MBW10010 |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 05850 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 |
| Fugene 6 | Roche | 11814443001 |
| polybrene | Sigma | H9268 |
| Object marker | Nikon | MBW10010 |
References
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mali, P., Chou, B. K., Yen, J., Ye, Z., Zou, J., Dowey, S., Brodsky, R. A., Ohm, J. E., Yu, W., Baylin, S. B., Yusa, K., Bradley, A., Meyers, D. J., Mukherjee, C., Cole, P. A., Cheng, L. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 28, 713-720 (2011).
- Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B. E., Jaenisch, R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., Pyle, A. D., Tchieu, J., Sridharan, R., Clark, A. T., Plath, K. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Dick, E., Matsa, E., Bispham, J., Reza, M., Guglieri, M., Staniforth, A., Watson, S., Kumari, R., Lochmuller, H., Young, L., Darling, D., Denning, C. Two new protocols to enhance the production and isolation of human induced pluripotent stem cell lines. Stem Cell Res. 6, 158-167 (2011).
- Ku, S., Soragni, E., Campau, E., Thomas, E. A., Altun, G., Laurent, L. C., Loring, J. F., Napierala, M., Gottesfeld, J. M. Friedreich’s ataxia induced pluripotent stem cells model intergenerational GAATTC triplet repeat instability. Cell Stem Cell. 7, 631-637 (2010).
- Emre, N., Vidal, J. G., Elia, J., O’Connor, E. D., Paramban, R. I., Hefferan, M. P., Navarro, R., Goldberg, D. S., Varki, N. M., Marsala, M., Carson, C. T. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5, e12148-e12148 (2011).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).
- Yu, J., Thomson, J. A., Lanza, R. Induced Pluripotent Stem Cell Derivation. Essentials of Stem Cell Biology. , 331-337 (2009).
- Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thomson, J. A. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Woltjen, K., Michael, I. P., Mohseni, P., Desai, R., Mileikovsky, M., Hamalainen, R., Cowling, R., Wang, W., Liu, P., Gertsenstein, M., Kaji, K., Sung, H. K., Nagy, A. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A., Daley, G. Q., Brack, A. S., Collins, J. J., Cowan, C., Schlaeger, T. M., Rossi, D. J. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
- Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R., Kim, K. S. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Han, S. S., Williams, L. A., Eggan, K. C. Constructing and deconstructing stem cell models of neurological disease. Neuron. 70, 626-644 (2011).
