우리는 그대로 마우스 망막에서 막대와 원뿔 photoresponses를위한 transretinal electroretinogram (에르그) 레코딩 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 가벼운 반응을 분리하고 분리된 평면 마운트 망막에 걸쳐 배치 필드 전극을 사용하여 그들을 기록하는 photoreceptors에서 시냅스 전송 블록의 활용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
막대와 원뿔 : 척추 망막에있는 이미지 성형 photoreceptors의 두 개의 클래스가 있습니다. 콘 빠르게 밝은 빛 조건을 변경 하에서 지속적으로 작동 반면 막대는 빛의 단일 광자를 감지할 수 있습니다. photoreceptors의 외부 세그먼트의 막대 및 원뿔 특정 시각 색소에 의한 빛의 흡수는 결국 플라즈마 막과 세포 hyperpolarization에 주기적 염기 - 게이트 채널의 폐쇄에 이르게 phototransduction 층계를 트리거합니다. 현재 및 잠재적인 멤브레인이 빛을 유도된 변화는 역시 클래식 흡입 전극 녹음 기술의 1,2이나 pharmacologically 차단 postsynaptic 응답 구성 요소 3-5과 격리된 망막에서 transretinal electroretinogram 레코딩 (에르그)에 의해, photoresponse로 등록하실 수 있습니다. 후자의 방법은 마우스 photoreceptors에서 약물 액세스할 지속적인 녹음이 가능하고 안정적인 photoresponses에게 금을 얻기 위해 특히 유용톰 부족하고 연약한 마우스 콘. 원뿔의 경우, 그러한 실험은 어두운 적응 6,7 동안 원뿔 photosensitivity 복구 과정을 모니터링하는 모두 본질적으로 모든 시각 색소 표백제로 닦았을 어두운 적응 조건과 다음과 같은 강렬한 조명으로 수행할 수 있습니다. 이 동영상에서 우리는 어두운 적응 마우스 망막에서 막대와 M / L, 원추 중심 transretinal 녹음을 수행하는 방법을 보여줍니다. 로드 녹음은 야생 유형 (C57Bl / 6) 생쥐의 망막을 사용하여 수행됩니다. 8 신호 막대 부족 생쥐. 단순 들어, 원뿔 음반은 유전자 변형로드 transducin에서 α-subunit 녹아웃 (- - / Tα) 얻을 것이다
프로토콜
1. 전극을 만들기
- 유리 전극을 준비합니다. 120 MG 한천 배지의 무게를 10 ML 증류수 (최종 한천 농도 1.2 %)에 섞는다. 온수 욕조에서 한천 솔루션을 용융. 플라스틱 주사기를 사용하여 한천 솔루션 : 유리 모세관 (길이 = 100mm, OD / ID = 1/0.75 mm, 내부 부피 = 44 μL 우리는 다음과 같은 차원으로 TW100-4 모세관 워드 Presision 악기 사용) 입력합니다. 10 분 상온에서 한천을 고체화. 따라서, 최대 ~ 200 모세 혈관이 (한천 혼합물의 나머지가 -4 ° C와 재 사용 여러 차례에 저장할 수) 충만 수 있습니다.
- 다이아몬드 나이프를 사용하여 반쪽으로 모세 혈관을 잘라요.
- 4 ° C.에 최소 24 시간 동안 마우스 전극 용액의 결과로 유리 전극을 적시게 4 ° C에서 전극을 저장하고 3~4개월의 기간 동안 그들을 사용합니다.
2. 실험 설정하기
- 하룻밤 사이에 마우스를 어두운 적응. (예를 들어, C, 야생 유형을 사용막대 중심 transretinal 녹음과 T α에 대한 57Bl / 6) 마우스 - / - 생쥐 부족한 봉은 원추 transretina....
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토론
막대와 원뿔 중심 transretinal 에르그 녹음의 방법은 야생 유형 및 유전자 변형 동물 모두에서 마우스 photoreceptors의 기능을 조사하는 강력한 도구되고 위에서 설명한. 기본 photoresponse 속성의 쉬운 특성뿐만 아니라,이 간단한 기술은 가까운 - 투 - 그대로 망막의 준비에서 수행 오랫동안 실험을하는 동안 좋은 반응 안정성을 제공합니다. 야생 형 마우스의 어두운 적응로드 최대한의 응답 진폭과 photosensitivity 모두 레코딩의 시작부터 적어도 1 시간 내에 안정이며, 어두운 적응 콘 최대한의 진폭과 photosensitivity는 일반적으로 30-40 분 후 10 % 이상을 거절하지 녹음. 이 기술의 다른 장점은 살아있는 동물의 에르그 기록을 수행하는 데 필요한 자사의 마우스 photoreceptors에서 고전적인 단일 셀 흡입 녹음에 연결할 수 없습니다 쉬운 pharmacological 조작에 복종할 의무, 그리고 마취의 부재입니다ings. / - - Tα의 망막 사용.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
실명을 방지하기 위해 연구에서 경력 개발 상을 지원, NIH 보조금 EY19312 및 EY19543 (VJK)뿐만 아니라 실명과 EY02687을 (워싱턴 대학에서 안과 및 Visual 과학 계열) 방지하기위한 연구에서 제한없이 부여함으로써.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| 자재 명칭 | 유형 | 회사 | 카탈로그 번호 | 논평 |
| DL-AP-4 | bioscience TOCRIS | 0101 | ||
| 기타 모든 시약 | 시그마 - 올드 리치 | |||
| 유리 모세관 | 세계 정밀 계측기 | TW100-4 | 전극을 만들기위한 | |
| 필터 종이 | HARG | Millipore | HABG01300 | |
| 광도계 | UDT 인 스트 루먼트 | S350 | 가벼운 교정을 위해 | |
| Radiometric 실리콘 센서 | UDT 인 스트 루먼트 | 221 | 가벼운 교정을 위해 | |
| 방진 테이블 | 기술 제조 주식 회사 | TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 | 기계적 소음을 최소화하려면 | |
| 공기 압축기 팬더 P 15TC | Werther 국제 | P 15TC | 방진 테이블에 연결 | |
| Stereomicroscope | LEICA | MZ9.5 | 마우스 눈 절개에 대한 | |
| 적외선 이미지 컨버터 | BEMeyers | ProwlerTM | stereomicroscope에 바인딩 | |
| 차동 증폭기 DP-311 | 워너 인 스트 루먼트 | DP-311 | ||
| 축삭 Digidata 1440A 디지타이저 | ; | 분자 장치 | 1440A | |
| 듀얼 채널 8 극 필터 | KROHN-HITE 주식 회사 | 3382 | ||
| 세라믹 저항 | TE 연결 | CGS SBCHE618RJ | 재관류 솔루션을 재가열에 대한 | |
| 열전대 | 티 | Physitemp 인 스트 루먼트 | IT-18 | |
| 온도 모니터 | 오메가 | DPi32 | 열전대에 연결됨 | |
| LED가 505 nm의 | TT 전자 / Optek 기술 | Digi-키 P / N 365-1185-ND | 테스트 섬광 / 표백 라이트를 적용하려면 | |
| 소작 펜 | Bovie | AA25 | 지느러미 부분을 마킹에 대한마우스 안구의 | |
| 10 전기 생리학 데이터 수집 및 분석 소프트웨어를 pCLAMP | 분자 장치 |
참고문헌
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
- Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. Physiological features of the S- an....
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재인쇄 및 허가
