Summary

Transretinal Recordings ERG de Retina do mouse: Rod e Photoresponses Cone

Published: March 14, 2012
doi:

Summary

Nós descrevemos um método relativamente simples de transretinal eletrorretinograma (ERG) para a obtenção de gravações photoresponses haste e cone da retina do rato intacto. Esta abordagem tira vantagem do bloco de transmissão sináptica de fotorreceptores para isolar as suas respostas de luz e gravar os usando eléctrodos de campo colocados através da retina plana montado isolado.

Abstract

Existem duas classes distintas de imagem formadoras de fotorreceptores na retina de vertebrados: bastonetes e cones. Rods são capazes de detectar fótons individuais de luz, enquanto cones operar continuamente sob rápidas mudanças das condições de luz brilhante. A absorção de luz pela vara e cone específicos pigmentos visuais nos segmentos exteriores de fotorreceptores desencadeia uma cascata de fototransdução que conduz eventualmente a encerramento de nucleótidos cíclicos-gated canais na membrana plasmática e hiperpolarização da célula. Esta mudança induzida pela luz em corrente e potencial de membrana pode ser registrado como um photoresponse, por qualquer de sucção 1,2 eletrodo clássica técnica de gravação ou por gravações eletrorretinograma transretinal (ERG) de retinas isoladas com farmacologicamente bloqueados componentes da resposta pós-sinápticos 3-5. O último método permite a droga acessíveis de longa duração gravações de fotorreceptores do rato e é particularmente útil para a obtenção de photoresponses estáveis ​​from os cones do mouse escassos e frágeis. No caso de cones, tais experimentos podem ser realizados tanto em condições de adaptação ao escuro e iluminação intensa seguinte que branqueia essencialmente todo o pigmento visual, para acompanhar o processo de recuperação fotossensibilidade cone durante a adaptação ao escuro 6,7. Neste vídeo, vamos mostrar como realizar vara e M / L-cone-driven gravações transretinal de escuro-adaptado retina mouse. Gravações haste irá ser efectuada utilizando retina do tipo selvagem (C57BL / 6) ratinhos. Por simplicidade, as gravações de cone será obtida a partir geneticamente modificado haste transducina α subunidade knockout (Tα – / -) ratinhos que carecem de haste de sinalização 8.

Protocol

1. Fazendo Eletrodos Prepare-se eletrodos de vidro. Pesar 120 mg de agar e misturá-lo em 10 mL de água destilada (concentração final de ágar 1,2%). Derreta a solução ágar-ágar em banho de água quente. Encha capilares de vidro (usamos Instruments Presision palavra TW100-4 capilares com as seguintes dimensões: comprimento = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm, eo volume interno = uL 44) com a solução de agar usando uma seringa de plástico. Solidificar o ágar, à temperatura ambiente durante 10 min. Assim…

Discussion

O método de vara e cone-driven gravações transretinal ERG descrito acima está se tornando uma poderosa ferramenta para investigar a função dos fotorreceptores do mouse tanto no tipo selvagem e animais geneticamente modificados. Além disso para a caracterização das propriedades de fácil photoresponse básicos, esta técnica simples fornece estabilidade grande resposta de longa duração, durante experimentos realizados em preparações próxima do intactas da retina. Ambos de adaptação ao escuro haste amplitu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Apoiado pelo Prémio Carreira de Desenvolvimento de Pesquisa para a Prevenção da Cegueira, NIH concede EY19312 e EY19543 (VJK), bem como pela concessão irrestrita de Pesquisa para a Prevenção da Cegueira e EY02687 (Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais da Universidade de Washington).

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
DL-AP-4   TOCRIS bioscience 0101  
All other reagents   Sigma-Aldrich    
Glass capillaries   World Precision Instruments TW100-4 For making electrodes
Filter paper HARG Millipore HABG01300  
Photometer   UDT Instruments S350 For light calibration
Radiometric silicon sensor   UDT Instruments 221 For light calibration
Anti-vibration table   Technical Manufacturing Corporation TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 To minimize mechanical noise
Air compressor Panther P 15TC   Werther International P 15TC Connected to anti-vibration table
Stereomicroscope   LEICA MZ9.5 For mouse eye dissection
Infrared image converters   B.E.Meyers ProwlerTM Bound to stereomicroscope
Differential amplifier
DP-311
  Warner Instruments DP-311  
Axon Digidata 1440A Digitizer   Molecular Devices 1440A  
Dual Channel 8-pole Filter   KROHN-HITE Corporation 3382  
Ceramic resistor   TE Connectivity CGS SBCHE618RJ For reheating the perfusion solution
Thermocouple T Physitemp Instruments IT-18  
Temperature monitor   Omega DPi32 Connected to thermocouple
LED 505 nm   TT Electronics/ Optek Technology Digi-key P/N 365-1185-ND To apply test flashes/bleaching light
Cautery pen   Bovie AA25 For marking the dorsal part of the mouse eyeball
pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software   Molecular Devices    

References

  1. Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
  2. Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings. J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).
  3. Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
  4. Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
  5. Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
  6. Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
  7. Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein. J. Neurosci. 31, (2011).
  8. Calvert, P. D. Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).
  9. Applebury, M. L. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27, 513-523 (2000).
  10. Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response. Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).
  11. Vinberg, F., Koskelainen, A. Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery. PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).
  12. Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).

Play Video

Cite This Article
Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses. J. Vis. Exp. (61), e3424, doi:10.3791/3424 (2012).

View Video