Microfluidic छोटी बूंद प्लेटफार्मों के लिए प्रतिदीप्ति तरीकों का पता लगाने

Summary

छोटी बूंद आधारित microfluidic प्लेटफार्मों उच्च throughput प्रयोग के लिए आशाजनक उम्मीदवार हैं क्योंकि वे picoliter, आत्म compartmentalized वाहिकाओं kHz दरों पर सस्ते में उत्पन्न करने में सक्षम हैं. तेजी से, संवेदनशील और उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी तरीकों के साथ एकीकरण के माध्यम से, इन प्रणालियों के भीतर उत्पन्न जानकारी की बड़ी मात्रा में कुशलता से निकाला जा सकता इस्तेमाल और उपयोग.

Abstract

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.¹

In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.^2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.

Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Protocol

1. माइक्रोचिप निर्माण निर्माण मास्टर SU8. 30 एस के लिए 40 सुक्ष्ममापी ऊंचाई, स्पिन कोट SU8 50 3000 rpm पर (MicroChem कार्पोरेशन) एक सी वफ़र पर microfluidic चैनलों प्राप्त 65 में एक गर्म थाली पर शीतल सेंकना ° सी के लिए 5 मिनट और 95 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 मिनट के लिए विलायक लुप्त हो जाना और फिल्म घना. नीचे ठंडा करने के बाद बेनकाब, SU8 300 / 2 MJ 360-440 एनएम विकिरण के साथ उपयुक्त मुखौटा के तहत विरोध . के बाद जोखिम, 65 में वफ़र सेंकना ° सी 4 मिनट के लिए 2 मिनट और 95 डिग्री सेल्सियस के लिए. ठंडा करने के बाद, 5 मिनट के लिए unexposed क्षेत्रों (Micrpoposit चुनाव आयोग विलायक, Chestech) सरगर्मी के साथ, विकास 5 का उपयोग करें. ताजा चुनाव आयोग वफ़र कुल्ला और फिर यह एक स्वच्छ सतह उत्पन्न गैस के तहत शुष्क विलायक. Hexane और मेथनॉल washes के साथ वफ़र समझो. Trichloro evaporating के अंतिम चरण (1,1,2,2 perfluoocytl) silane सतह पर (40 मिनट के लिए एक desiccator में) के साथ SU8 मास्टर निर्माण की प्रक्रिया को पूरा करें. PDMS curinजी, dicing और छेद छिद्रण. संरचित microfluidic substrates के फार्म करने के लिए, हम crosslinker के लिए राल के एक 10:1 अनुपात (w / w) में 184 Sylgard (डॉव Corning) मिश्रण और तब मास्टर पर डाल देना. एक desiccator में देगास, और फिर एक घंटे के लिए 65 पर डिवाइस (ऊपर परत) का इलाज डिग्री सेल्सियस ठीक PDMS और मास्टर बंद इसे छील कट. Fluidic टयूबिंग के लिए एक बायोप्सी पंच का उपयोग का उपयोग छेद बनाएँ. PDMS की एक और परत (एक 10×10 सेमी पेट्री डिश में समान रूप से फैल राल के 8 ग्राम) 20 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस का इलाज नीचे की परत पर तैयार ऊपर परत प्लेस और फिर 65 में रातोंरात इलाज डिग्री सेल्सियस पेट्री और पकवान उपयोग के लिए पासा से चिप्स पील. 2. प्रायोगिक सेटअप Microfluidic सेटअप आवश्यक समाधान के साथ सीरिंज (या Beckton, डिकिंसन और कंपनी से या SGE विश्लेषणात्मक विज्ञान से प्लास्टिक और कांच) भरें, यह सुनिश्चित करना कोई हवाई बुलबुले टयूबिंग के किसी भी हिस्से में रहते हैं. छोटी बूंद पीढ़ी के लिए दो चरणों का इस्तेमाल कर रहे हैं. जलीय फंस (छितरी)ई ब्याज की अभिकर्मकों (उदाहरण के लिए मध्यम विकास में कोशिकाओं का एक निलंबन, या आणविक fluorophores के एक समाधान) शामिल हैं. तेल चरण, जो इस मामले में निरंतर चरण के रूप में कार्य करता है आम तौर पर तेल और surfactant का एक मिश्रण है, जैसे fluorinated तेल में 2% Raindance surfactant (Raindance टेक्नोलॉजीज) (3M Fluorinert इलेक्ट्रॉनिक लिक्विड एफसी 40) से बनाई है, या 2% अवधि में खनिज तेल (Croda) 80. एक सुई के लिए अंत पर सिरिंज सुई सुझावों के रूप में ही आंतरिक व्यास के टयूबिंग (Polyethylene टयूबिंग, हार्वर्ड उपकरण) फ़िट. टयूबिंग कम से कम संभव लंबाई के लिए कंपन perturbations के कारण प्रवाह instabilities को कम करने के लिए कटौती की जानी चाहिए. सीधे PDMS सब्सट्रेट में छिद्रित छेद टयूबिंग की दूसरे छोर से कनेक्ट करें. सिलिका केशिका बंदरगाहों या कनेक्टर्स (जैसे Upchurch Nanoports) के उपयोग जैसे अधिक जटिल समाधान भी microfluidic युक्ति और टयूबिंग के बीच एक और अधिक मजबूत इंटरफ़ेस के लिए लागू किया जा सकता है. आउटलेट कनेक्टटयूबिंग और एक कलेक्टर (अपशिष्ट संग्रह या आगे analyte प्रसंस्करण के लिए) में प्रत्यक्ष करने के लिए चिप के बंदरगाह. एक सिरिंज पंप (जैसे पीएचडी 4400 Hpsi प्रोग्राम सिरिंज पंप, हार्वर्ड उपकरण) पर सीरिंज पर्वत और प्रत्येक चरण (आमतौर पर प्रति मिनट microliters के आदेश पर) के लिए वांछित infusing प्रवाह दर को परिभाषित. तेल / जलीय 1 के प्रवाह दरों का एक न्यूनतम अनुपात जलीय चरण है, जो अस्थिर छोटी बूंद गठन (डिवाइस ज्यामिति के आधार पर) के लिए नेतृत्व करेंगे द्वारा PDMS के गीला से बचने के लिए सिफारिश की है. उसी कारण से, यह भी पहली बार तेल चरण अकेले फ्लश किसी भी microfluidic चैनलों के माध्यम से जलीय चरण की शुरूआत से पहले, की सिफारिश की है. अंतिम प्रयोगों यहाँ के लिए इस्तेमाल किया सेटअप चित्रा 2a में सचित्र है . ऑप्टिकल प्रणाली सेटअप उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ microfluidic चैनलों के भीतर छोटे संस्करणों (कुछ picoliters नीचे) की जांच (आटोमैटिक मशीन के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग करेंएड submicron पोजीशनिंग क्षमता). आदर्श उच्च मात्रा पैदावार के साथ पानी में घुलनशील फ्लोरोसेंट अणु का प्रयोग करें. एक तरंग दैर्ध्य है कि शामिल की fluorophore अवशोषण मैचों में एक लेजर ऑपरेटिंग का उपयोग करने अणुओं उत्तेजित. उदाहरण के लिए, 5-आइसोथियोसाइनेट fluorescein (FITC) और एलेक्सा-Fluor 488 के रूप में आम फ्लोरोसेंट अणु कुशलता से एक 488 एनएम लेजर डायोड (जैसे PicoQuant Gmbh, LDH-पीसी-485) का उपयोग कर उत्साहित कर सकते हैं. फ्लोरोसेंट अणु, टेक्सास रेड या Allophycocyanin (APC) के रूप में कुशलतापूर्वक 633 एनएम पर exited उपयोग किया जा सकता है एक वह / Ne लेजर (जैसे न्यूपोर्ट आर 31,425). स्पंदित कई मेगाहर्ट्ज की पुनरावृत्ति की दर (कई एनएस पल्स separations के साथ) और प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग (Flim) प्रयोगों के लिए पर्याप्त विभेदित जीवनकाल गुणों के साथ fluorophores पर ऑपरेटिंग लेज़रों का प्रयोग करें. बीम स्टीयरिंग दर्पण और प्रकाशिकी का उपयोग करने के लिए बीम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बीम दिशा ऊंचाई नियंत्रण. Dichroic दर्पण का उपयोग करने के लिए उद्देश्य एल में लेजर बीम को प्रतिबिंबितसत्ता. यदि दो लेज़रों के साथ उपयोग किया जाता है, एक दोहरी बैंड dichroic दर्पण दो लेजर बीम (488 और 633 एनएम बीम के लिए जैसे Chroma प्रौद्योगिकी निगम से एक z488/633rdc दर्पण आदर्श है) का प्रतिबिंब की अनुमति देने के लिए स्थापित किया जा सकता है. एक अनंत को सही उच्च (एनए) संख्यात्मक एपर्चर खुर्दबीन उद्देश्य (यानी 60 ओलिंप / 1.2 x एनए, पानी विसर्जन) का उपयोग एक microfluidic चैनल के भीतर एक तंग ध्यान केंद्रित करने के लिए लेज़र प्रकाश लाने के लिए. जब लंबा microchannels (> 100 सुक्ष्ममापी) के साथ काम करने की आदत उद्देश्य उचित होना करने के लिए सुनिश्चित करें कि अपने काम दूरी प्रभावी ढंग से microchannel की पूरी ऊंचाई शामिल करने के लिए चुना जाना चाहिए. नमूना ही उच्च एनए उद्देश्य और उसी dichroic दर्पण के माध्यम से प्रेषित का उपयोग microfluidic चैनल के अंदर () के द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति लीजिए. एक एकल या दोहरी बैंड उत्सर्जन फिल्टर (जैसे Chroma प्रौद्योगिकी निगम से एक z488/633 फिल्टर) का उपयोग कर किसी भी अवशिष्ट उत्तेजना प्रकाश निकालें. प्रतिदीप्ति घाव फोकसn एक 75 सुक्ष्ममापी एक Plano-मध्योन्नत लेंस (जैसे एफ 50.2, न्यूपोर्ट लिमिटेड) का उपयोग pinhole पर. खुर्दबीन उद्देश्य के confocal विमान में pinhole स्थिति. दो डिटेक्टरों पर फ्लोरोसेंट संकेत विभाजित एक और dichroic दर्पण का उपयोग करें (जैसे 630dcxr, Chroma प्रौद्योगिकी निगम). एक उत्सर्जन फिल्टर (जैसे Chroma प्रौद्योगिकी निगम से एक hq540/80 मीटर फिल्टर) के साथ dichroic दर्पण से परिलक्षित प्रतिदीप्ति फ़िल्टर और यह एक Plano-मध्योन्नत लेंस के साथ ध्यान केंद्रित (जैसे च = 30.0, आईडी 25.4 मिमी, Thorlabs) पहली पर ( 'हरी') डिटेक्टर. एक माध्यमिक लाल fluorophore शामिल प्रयोगों के दूसरे उत्सर्जन फिल्टर (जैसे Chroma प्रौद्योगिकी निगम से एक hq640lp फिल्टर) के साथ dichroic दर्पण के माध्यम से प्रेषित प्रतिदीप्ति फिल्टर और फिर एक और Plano-मध्योन्नत लेंस के साथ यह दूसरी डिटेक्टर ('लाल') पर ध्यान केंद्रित. प्रतिदीप्ति फोटॉनों का पता लगाने के लिए हिमस्खलन photodiodes (जैसे 141 – AQR ईजी एंड जी, Perkin – Elmer) का प्रयोग करें. अंतिम सेटअप में सचित्र है <strong> चित्रा 2b. 3. छोटी बूंद पीढ़ी और डाटा अधिग्रहण छोटी बूंद पीढ़ी तरीकों आप microchannels के दो मुख्य विन्यास का उपयोग करने के लिए बूंदों उत्पन्न कर सकते हैं: एक प्रवाह ध्यान केंद्रित या टी जंक्शन स्वरूप (चित्रा 3a और 3b) 6,7 दोनों तरीकों में लंबे समय के रूप में बराबर के रूप में गठन बूंदों के रूप में ही microchannel के रूप में विस्तृत रहे हैं.. कतरनी बलों है कि इन geometries का उपयोग करने के लिए दो अमिश्रणीय तरल पदार्थ को एक साथ लाने और बाद में केशिका instabilities है कि इंटरफ़ेस में विकसित, monodisperse बूंदों (के रूप में कुछ femtoliters के रूप में छोटे) अनायास उत्पन्न कर रहे हैं से उठता है की एक परिणाम के रूप में. आप अलग अलग तरीकों से अभिकर्मकों encapsulate कर सकते हैं: अभिकर्मकों और तैयार किया जा सकता है मिश्रित चिप बंद वांछित मिश्रण / एकाग्रता के लिए, या वे चिप में अलग से लाया जा सकता है और तब पहले छोटी बूंद गठन (चित्रा -3 सी) के लिए एक साथ संयुक्त. यहपिछले विधि उच्च लचीलेपन के लिए प्रदान करता है के बाद से मिश्रण / सांद्रता बस रिश्तेदार प्रवाह दर ट्यूनिंग द्वारा संशोधित किया जा सकता है. यहां यह उल्लेखनीय है कि सेल encapsulation के लिए, सिरिंज में सेल निलंबन के लिए कोशिकाओं के प्रयोग के timescale पर संक्षेपण से बचने उभारा होना चाहिए. प्रतिदीप्ति डेटा अधिग्रहण. लॉगिंग युगल हिमस्खलन photodiode डिटेक्टर (2.2.12 में वर्णित) से इलेक्ट्रॉनिक डेटा के लिए एक multifunction DAQ डिवाइस के लिए संकेत (उदाहरण के लिए एक PCI 6602, नेशनल इंस्ट्रूमेंट्स), एक व्यक्तिगत कंप्यूटर पर चल रहा है. Flim प्रयोगों को एक समय सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती डिटेक्टरों कनेक्ट (TCSPC) कार्ड (जैसे 100 TimeHarp, PicoQuant GmbH) एक अलग पीसी पर चल रहा है. यह कार्ड प्रतिदीप्ति जीवनकाल डेटा के लिए अनुमति देता है एक TCSPC पद्धति का उपयोग करके प्राप्त किया जा: प्रत्येक का पता चला फ्लोरोसेंट फोटॉन एक घटना लेजर पल्स सहसंबद्ध है, और इसलिए प्रत्येक उत्सर्जित फ्लोरोसेंट फोटॉन एक देरी समय सौंपा है. इस डेटाएक एकल या बहु घातीय क्षय वक्र / fluorophore विकिरणवाला दर गुणांक / एस के एक अनुमान प्राप्त करने के लिए फिट किया जा सकता है डिटेक्टर के साधन प्रतिक्रिया समारोह (IRF) के साथ कच्चे डेटा Deconvolute: यह एक कम एकाग्रता समाधान Auramine हे (जो कुछ picoseconds के एक प्रतिदीप्ति जीवनकाल दर्शाती है) का उपयोग कर प्राप्त किया जाता है 8. 4. सेल और बूंदों के भीतर मिश्रण की मान्यता मानचित्रण सेल और बूंदों के भीतर मिश्रण की मान्यता मानचित्रण Escherichia कोलाई शीर्ष व्यवहार्यता परख प्रयोग के लिए 10 तनाव का प्रयोग करें . संस्कृति Luria – Bertani रातोंरात शोरबा में कोशिकाओं और ऑप्टिकल घनत्व 0.5 से मैच प्रयोगों के लिए पहले. कक्षों की व्यवहार्यता का पता लगाने के लिए 0.4 SYTO9 सुक्ष्ममापी और एक सुक्ष्ममापी propidium आयोडाइड का उपयोग करें. दोनों डीएनए intercalating रंजक हैं और उनके प्रतिदीप्ति तीव्रता डीएनए के लिए बाध्य करने पर 20 से अधिक परतों बढ़ जाती है. SYTO9 हरी फ्लोरोसेंट रंजक है कि मुझे हैmbrane पारगम्य और propidium आयोडाइड एक लाल फ्लोरोसेंट रंजक है जो झिल्ली अभेद्य है. इस प्रकार जीवित कोशिकाओं 'हरी' प्रतिदीप्ति जबकि मृत कोशिकाओं दोनों 'हरी' और 'लाल' उत्सर्जन प्रदर्शन. 2.2 में शुरू की हरी / लाल प्रतिदीप्ति पता लगाने के लिए सेटअप) का प्रयोग करें. एक पोर्टेबल, मिनी चुंबकीय दोषी (यूटा Biodiesel आपूर्ति, यूटा) का प्रयोग एक 3ml बी.डी. plastipak एक 7mm चुंबकीय हलचल सेल अवसादन को रोकने बार के साथ लगे सिरिंज के भीतर सेल निलंबन हलचल. मिश्रण Flim घटनाओं का उपयोग मानचित्रण एक microchannel जो साथ बूंदों बह रही हैं की आधी ऊंचाई पर फोकस ऑप्टिकल जांच की मात्रा. दो जलीय समाधान (चित्रा -3 सी में), विभिन्न विशेषता फ्लोरोसेंट जन्मों के साथ एक fluorophore (गैर बातचीत) से युक्त प्रत्येक प्रपत्र बूंदों. चैनल के एक तरफ से शुरू, एक सुक्ष्ममापी अंतराल पर चैनल की पूरी चौड़ाई के साथ एक प्रयोग ले. चैनल एडges आसानी से के रूप में प्रतिदीप्ति तीव्रता काफी बूँदें एक बार उनकी निकटता में लेजर बीम ध्यान केंद्रित की पहचान कर सकते हैं. तेल चरण के शोर पृष्ठभूमि से संकेत फटने (बूंदों के साथ जुड़े) अंतर और प्रत्येक फट की अवधि स्थापित करने के लिए एक एल्गोरिथ्म को लागू करने. एक दूसरे एल्गोरिथ्म कार्यान्वित करने के लिए एक छोटी बूंद की लंबाई के साथ विशेष चौड़ाई जहां प्रयोग किया गया है निकालने देरी समय और तीव्रता मूल्यों 9. फिर एक अधिकतम संभावना अनुमानक एल्गोरिथ्म (MLE) का उपयोग करने के लिए प्रयोग में प्रत्येक छोटी बूंद के लिए प्रतिदीप्ति जीवन भर का मूल्यांकन 8 औसत प्रयोग में सभी बूंदों के लिए जीवन भर मूल्यों, MLE गणना के अंतिम त्रुटि (अधिक बूंदों की जांच की, कम कर देता है. छोटे त्रुटि). एक बार एक जीवनकाल प्रक्षेपवक्र प्रत्येक चौड़ाई के लिए प्राप्त किया गया है, एक 2d नक्शा में सभी trajectories गठबंधन. चूंकि प्रत्येक जीवन मूल्य खासकर के साथ जुड़ा हुआ हैLar के दो fluorophores के मिश्रण है, एकाग्रता (या मिश्रण) नक्शे इस प्रकार प्राप्त किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, छोटी बूंद मिश्रण का एक 3 डी मानचित्र आसानी से विभिन्न पदों पर microfluidic चैनल के ऊंचाई के साथ इस प्रोटोकॉल दोहरा द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. 5. डेटा विश्लेषण कच्चे उचित कंप्यूटिंग भाषा में प्रयोगात्मक डेटा फ़ाइलों reinterpret ताकि वे आगे से विश्लेषण किया जा सकता है (जैसे पाठ फ़ाइलें जिनमें समय पर फोटोन गिनती की भिन्नता, डाटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण के लिए आसानी से किया जा सकता है Matlab में निकाले). आप के लिए विशिष्ट कोड लिखने के क्रम में MLE एल्गोरिदम चलाने के लिए या जीवनकाल trajectories से मिश्रण patters के 2 डी नक्शे बनाने के लिए अधिक जटिल प्रयोगों की फ़ाइलें (जैसे flim के लिए उन लोगों के रूप में) या क्रम में निहित डेटा का उपयोग हो सकता है. 6. प्रतिनिधि परिणाम सेल मान्यता Var के विशिष्ट उदाहरणसेल आधारित प्रयोगों के लिए समय के एक समारोह के रूप में फोटोन गिनती की iation आंकड़े 4a और ग में दिखाया गया है, दो सौ मिलीसेकेंड की अवधि से अधिक. महत्वपूर्ण बात Luria Bertani शोरबा (लेग मध्यम) एक कमजोर fluorescing जलीय छोटी बूंद सीमाओं को परिभाषित पृष्ठभूमि के रूप में कार्य करता है, अलग फोटॉन फटने, व्यक्ति की कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए इसी, whilst इस पृष्ठभूमि के शीर्ष पर प्रतिष्ठित किया जा सकता है. लेग फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि लगभग एक आयताकार पार अनुभाग (लाल और हरे रंग डॉटेड रेखाओं द्वारा चिह्नित) द्वारा विशेषता है. फ्लोरोसेंट फटने की पूरी चौड़ाई आधा अधिकतम (FWHM) ई. से उत्पन्न होने वाली कोलाई कोशिकाओं 30 गुना पृष्ठभूमि छोटी बूंद घटनाओं, जो बूंदों के रिश्तेदार लंबाई (40 microns, 30 picolitres की मात्रा करने के लिए इसी) और ई. के साथ संगत है की तुलना में कम है कोलाई कोशिकाओं (1.5-2.0 माइक्रोन) 10. दोहरी चैनल का पता लगाने के साथआयन प्रणाली, जीवित कोशिकाओं या मृत कोशिकाओं के अस्तित्व हरे और लाल चैनलों के विश्लेषण से प्रतिष्ठित किया जा सकता है आंकड़े 4 ख और घ. दिखाने प्रायिकता वितरण छोटी बूंद प्रति कोशिकाओं की संख्या का वर्णन. मिश्रण Flim घटनाओं का उपयोग मानचित्रण आणविक प्रतिदीप्ति जीवनकाल एक व्यक्ति fluorophore है कि उसके रासायनिक पर्यावरण से ही प्रभावित होता है एक आंतरिक संपत्ति है. तदनुसार अपने माप के लिए बेहतर और समय एकीकृत प्रतिदीप्ति माप, जो जैसे एकाग्रता, उत्तेजना तीव्रता, और ऑप्टिकल संग्रह प्रयोगात्मक (कारकों पर निर्भर कर रहे हैं की तुलना में संकल्प और परिशुद्धता के साथ पर्यावरण जानकारी (जैसे समाधान पीएच, तापमान, polarity और चिपचिपापन) प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ). दक्षता 9,11 जैसा कि कहीं प्रस्तुत 8, यह संभव है di के साथ दो fluorophores का उपयोग करके बूंदों के अंदर मिश्रण पैटर्न नक्शाfferent जीवनकाल मूल्यों. एक दो (गैर बातचीत) फ्लोरोसेंट प्रजातियों युक्त मिश्रण में क्षय एक biexponential फार्म पर ले के रूप में 1 समीकरण में दिखाया गया है: व्यक्तिगत जन्मों τ1 और τ2 के रूप में परिभाषित कर रहे हैं, और प्रत्येक घटक के आयाम α1 और α2 के द्वारा दिया जाता है क्रमशः. औसत जीवनकाल तो के रूप में परिभाषित किया जा सकता है: कहाँ β1 और β2 प्रत्येक घटक के अंश हैं और के रूप में परिभाषित कर रहे हैं: चूंकि जांच की मात्रा तय है और बूंदों कि स्थिति के पार बह रही हैं, जीवन भर के एक प्रक्षेपवक्र है कि विशेष रूप से चौड़ाई में बूंदों की लंबाई के साथ मूल्यों इस प्रकार प्राप्त किया जा सकता है. एक विशेष चौड़ाई के लिए एक विशेषता प्रक्षेपवक्र, averagएड, 6000 बूंदों के बीच चित्रा 5a में मनाया जा सकता है . चैनल की पूरी चौड़ाई भर trajectories के संयोजन एक 2d (या मिश्रण) एकाग्रता नक्शे के गठन की ओर जाता है है. एक ठेठ परिणाम चित्रा 5b में प्रस्तुत किया है. बूंदों की एक बड़ी संख्या के बीच परिणाम औसत से प्राप्त परिणामों के मानक त्रुटि बहुत (चित्रा 5a के लिए एक 95% विश्वास अंतराल के साथ मानक त्रुटि के 1%) कम किया जा सकता है. जीवनकाल प्रक्षेपवक्र का निर्धारण विधि यह मानता है कि सभी बूंदों व्यावहारिक रूप से समान हैं. अगर बूंदों काफी अलग थे, औसतन जीवनकाल प्राप्त trajectories, चापलूसी होगा कम अपसारी प्रोफाइल (और औसत बूंदों लंबाई के साथ जीवन में तेज मतभेद हैं लगातार पता चला): यह मोटे तौर पर दो मुख्य कारणों के लिए सही साबित हो जाता है. इसके अलावा, परिणाम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य व्यक्ति की परवाह किए बिना कर रहे हैंबूंदों का विश्लेषण या बूंदों की राशि परिकलनों में उपयोग किया 8. चित्रा 1. Microfluidic चिप निर्माण प्रक्रिया प्रवाह. चित्रा 2) सिरिंज पंप और सीरिंज, छोटी बूंद गठन के लिए microfluidic चिप से जुड़ा प्रतिनिधित्व आरेख, ख) एक दो लेजर के लिए एक ठेठ ऑप्टिकल सेटअप के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व – दो (हरे और लाल) fluorophore उत्तेजना और पहचान . डीसी = Dichroic दर्पण, EM = उत्सर्जन फिल्टर, एल = लेंस, पीएच = पिन छेद, APD = हिमस्खलन photodiode डिटेक्टर. चित्रा 3 पर चिप छोटी बूंद गठन रणनीतियों: एक) प्रवाह ध्यान केंद्रित विन्यास, ख) टी जंक्शन विन्यास. ग) डॉ. में चिप encapsulation मेंदो मूल अलग जलीय अभिकर्मकों oplets. चित्रा 4 0.2 एस (क) मृत के लिए दर्ज निशान के ऑप्टिकल readout और (ग) जीवित कोशिकाओं (सेल निलंबन के लिए प्रवाह दर: 1 μl मिनट -1, तेल: 2 μl मिनट -1). . प्रत्येक मेहराब के आकार का संकेत कमजोर फ्लोरोसेंट लेग मध्यम है कि छोटी बूंद धराशायी लाइनों के साथ चिह्नित सीमाओं के साथ जलीय छोटी बूंद रूपों से मेल खाती है है. ग्रीन संकेतों 633 एनएम तरंगदैर्य पर 633nm और लाल संकेतों के तहत readout प्रतिनिधित्व करते हैं. कक्ष ऊर्ध्वाधर डीएनए intercalating रंगों से उत्पन्न होने वाली कील द्वारा प्रतिष्ठित हैं. (ख) मृत कोशिकाओं और (घ) जीवित कोशिकाओं के लिए एकल बूंदों के भीतर सेलुलर अधिभोग के लिए प्रायिकता वितरण. चित्रा 5) विशिष्ट लंबाई के साथ एक विशेष चौड़ाई पर एक छोटी बूंद के औसतन जीवनकाल प्रक्षेपवक्र, ख).सभी औसतन trajectories के संयोजन की विशिष्ट प्रतिनिधित्व बूंदों से भरा चौड़ाई के साथ एक 2d जीवनकाल (या एकाग्रता% / FITC% Str AF488 के रूप में व्यक्त) नक्शे में जांच की.

Discussion

हम एक microfluidic डिवाइस के निर्माण, एक प्रयोगात्मक सेटअप और microdroplet गठन और अभिकर्मक encapsulation और प्रसंस्कृत बूंदों ऑप्टिकल पता लगाने के लिए जुड़े प्रोटोकॉल का वर्णन किया है. दो उदाहरण चयनित (बूंदों में एकल कक्षों का पता लगाने और बह बूंदों के अंदर मिश्रण प्रक्रियाओं मानचित्रण) सामान्य अनुप्रयोगों है कि वर्तमान में छोटी बूंद microfluidics के साथ जांच की जा रही है प्रतिनिधित्व करते हैं.

के रूप में प्रस्तुत प्रयोगों का वर्णन, छोटी बूंद microfluidic प्लेटफार्मों के उपयोग के उच्च throughput, अर्ध – सही कारावास, उच्च reproducibility … उत्पादन जानकारी की बड़ी राशि और उच्च गति, जिस पर इस जानकारी को उत्पन्न किया जा रहा है जैसे कुछ आकर्षक विशेषताओं, हालांकि वर्तमान,, उच्च spatiotemporal संकल्प के साथ तेजी से तरीकों का पता लगाने के उपयोग की आवश्यकता होती है अगर पूरा लाभ के लिए इन छोटी प्लेटफार्मों से प्राप्त किया जा रहा है. हम इस मामले में दिखाना है कि यहसंभव बेहद सटीक फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग कर. विशेष रूप से, Flim पहचान तकनीक (जो कुछ एनएस के रूप में कम के रूप में पुनरावृत्ति समय के साथ एक स्पंदित लेजर का उपयोग करता है) तेजी से बह बूंदों (प्रति सेकंड 200 के आसपास) से बहुत तेजी से जानकारी प्राप्त करने की क्षमता का पता चलता है. इस मामले में पता चला घटनाओं के समय संकल्प के रूप में 1 μs के रूप में कम किया गया था. छोटी बूंद के आकार और एकाग्रता में सीमा के मामले में, बड़े संख्यात्मक एपर्चर लेंस और बड़ा शक्ति लेज़रों के उपयोग में आसानी के रूप में 5 सुक्ष्ममापी (छोटी बूंद के आकार में सीमाओं photolithographic के संकल्प द्वारा लगाया जा रहा है के रूप में छोटी बूंदों के भीतर एनएम सांद्रता का पता लगाने की अनुमति होगी submicron स्थिति चरण के निर्माण की प्रक्रिया).

Microfluidic बूंदों के लिए बाहर बड़े पैमाने पर प्रयोग अभिकर्मकों की छोटी मात्रा में शामिल करना, एकल लक्ष्य / घटना के लिए नीचे के लिए आदर्श उम्मीदवार हैं. इस तकनीक की वर्तमान सीमाओं डॉ. उत्पन्न कठिनाई शामिलएक उच्च throughput ढंग में विभिन्न स्रोतों का एक विशाल विविधता (दसियों या सैकड़ों) oplets. इसके अतिरिक्त, कठिनाई के लिए लक्ष्य और प्रत्येक एकल उत्पन्न छोटी बूंद में हेरफेर के लिए इन तकनीकों का व्यावहारिक प्रयोज्यता गंभीर सीमाएं लगाता है. इसलिए, इन मुद्दों को आवश्यक तकनीकी समाधान है कि microfluidic छोटी बूंद प्लेटफार्मों को सक्षम करने के लिए उच्च throughput अनुप्रयोगों में अनुसंधान और विश्लेषण का एक मानक संदर्भ विधि बन जाएगा विकसित करने के उद्देश्य से महत्वपूर्ण अनुसंधान के प्रयासों के केंद्र में हैं.

Materials

Name of the reagent	Type	Company	Catalogue number
Fluorescein 5-isothiocyanate (FITC)	Reagent	Sigma-Aldrich	F3651
Streptavidin-Alexa Fluor 488	Reagent	Molecular Probes	S11223
Perfluorodecalin	Reagent	Sigma-Aldrich	P9900
1H,1H,2H,2H-perfluorooctanol	Reagent	Sigma-Aldrich	370533
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Reagent	Premier Farnell UK LTD	1673921
auramine-O	Reagent	Sigma-Aldrich	861030
485 nm pulsed diode laser	Equipment	PicoQuant	LDH-P-C-485
TCSPC Card	Equipment	PicoQuant	TimeHarp 100
dichroic mirror	Equipment	Chroma Technology Corp.	z488rdc,
Microscope objective	Equipment	Olympus	UPLSAPO 60XW
Avalanche photodiode	Equipment	AQR-141, EG&G, Perkin-Elmer).	AQR-141
DMEM	Reagent	Invitrogen	ABCD1234
SYTO9	Reagent	Invitrogen	S34854
Propidium Iodide	Reagent	Invitrogen	P3566
Escherichia coli top 10 strain	Cells	Invitrogen	C4040-10