Mesure de cytosolique de Ca 2 + En isolé lymphatique contractiles

Summary

Nous introduisons une approche pour évaluer la cytosolique de Ca<sup> 2 +</supConcentration> dans les vaisseaux lymphatiques isolés pour étudier Ca^{2 +} Ca-dépendante et^{2 +} Sensibilisant les mécanismes de la contraction musculaire lisse lymphatique.

Abstract

Les vaisseaux lymphatiques constituent un système de transport multifonctionnel qui maintient l'homéostasie des fluides, offre des lipides dans la circulation centrale, et agit comme un système de surveillance pour les antigènes potentiellement dangereux, l'optimisation de l'immunité des muqueuses et des réponses immunitaires adaptatives ^1. La lymphe est formé à partir du liquide interstitiel qui pénètre aveugle clos lymphatiques initiaux, puis est transporté contre un gradient de pression dans les grandes lymphatiques collecte. Chaque lymphatique collecte est constitué d'une série de segments appelés lymphangions, séparées par des valves bicuspides qui empêchent le reflux. Chaque lymphangion possède un cycle de contraction qui propulse lymphatiques contre un gradient de pression vers la circulation centrale ^2. Ce schéma est analogue phasique contractiles au cycle cardiaque, avec la tension systolique et diastolique phases, et avec une fréquence inférieure ⁴ de contraction. En outre, les muscles lisses lymphatique génère ton et affiche une constriction myogénique et la dilatation in réponse aux augmentations et des diminutions de la pression luminale, respectivement ^5. Un hybride des mécanismes moléculaires qui favorisent à la fois la contractilité phasique et tonique du système lymphatique sont ainsi proposées.

Contraction du muscle lisse est généralement réglementé par le Ca ^{2 +} cytosolique de concentration ([Ca ^{2 +]} _i), plus la sensibilité au Ca ^{2 +,} des éléments contractiles en réponse aux changements dans l'environnement entourant la cellule ^6. [Ca ^{2 +]} _i est déterminée par la combinaison du mouvement de Ca ^{2 +} à travers la membrane plasmique ligand ou la tension fermée canaux Ca ^{2 +} et de la libération et l'absorption de Ca ^{2 +} dans les magasins internes. Cytosolique de Ca ^{2 +} se lie à la calmoduline et active les enzymes telles que la chaîne légère de myosine (MLC) kinase (MLCK), qui à son tour phosphoryle MLC menant à l'actine-myosine médiée contraction de ^8. Cependant, la sensibilité de cette voie à Ca <sup> 2 + peut être réglementée par la phosphatase MLC (MLCP) ^9. L'activité est réglementée par MLCP Rho kinase (ROCK) et la protéine myosine inhibiteur de phosphatase IPC-17.

Ici, nous présentons une méthode pour évaluer les changements de [Ca ^{2 +]} _i au cours du temps dans des régions isolées, les lymphatiques perfusé afin d'étudier Ca ^{2 +-dépendante} et Ca ^{2 +-sensibilisant} les mécanismes de la contraction musculaire lisse lymphatique. L'utilisation isolée lymphatiques mésentériques du rat collecte que nous avons étudié l'étirement induit des changements de [Ca ^{2 +]} _i et de l'activité contractile. Le modèle lymphatique isolé offre l'avantage de pression, débit, et la composition chimique de la solution de bain peut être étroitement contrôlées. [Ca ^{2 +]} _i est déterminé par le chargement des lymphatiques avec les ratiométrique, Ca ^{2 +} contraignant colorant Fura-2. Ces études fourniront une nouvelle approche au problème plus large de l'étude des différents mécanismes moléculaires qui régulent phasiquecontractions toniques contre la constriction des muscles lisses lymphatique.

Protocol

1. Animaux Toutes les procédures ont été approuvées par les soins des animaux et du Comité institutionnel Utilisez à la Louisiana State University Health Sciences Center et ont été réalisées en conformité avec les directives du National Institute of Health (NIH Publication No. 85-12, révisée en 1996). Des rats Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, 270-350 g de poids corporel) ont été logés dans une température contrôlée (22 ° C) et un éclairage contrôlé (12:12 h cycle lumineux som…

Discussion

Une nouvelle combinaison de méthodes a été employée pour étudier intrinsèques de pompage des vaisseaux lymphatiques. La capacité de mesurer simultanément les variations de [Ca ^{2 +]} _i et de diamètre dans les vaisseaux lymphatiques de pompage permettra à des études sur les contributions relatives de Ca ^{2 +-dépendante} et Ca ^{2 +-sensibilisant} les voies de signalisation dans le mécanisme global régissant le cycle lymphatique contractiles.

…

Materials

<tdChemical

1. Ringer 5x Stock
Company	Catalog Number	Amount
Sodium Chloride	EMD	SX0420-3	35 g
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040	1.75 g
Calcium Chloride	Sigma	C-3881	1.47 g
Magnesium Sulfate	Sigma	M-9397	1.44 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
2. MOPS buffer
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
MOPS	Sigma	M3183	125.6 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
3. Albumin Physiological Salt Solution (APSS)
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
Ringer stock (5x)	N/A	N/A	200 mL
Mops Buffer	N/A	N/A	5 mL
Sodium Phosphate	Sigma	S-9638	0.168 g
Sodium Pyruvate	Sigma	P5280	0.22 g
EDTA sodium salt	Sigma	ED2SS	0.0074 g
Glucose	Sigma	G7528	0.901 g
Albumin, Bovine	USB	10856	10 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Adjust pH to 7.4 at 37° C, then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C.

Table 1. Specific Reagents Used. Store all at 4 °C.