Die Messung der cytosolischen Ca 2 + In Isolated Kontraktile Lymphgefäße

Summary

Wir stellen eine Annäherung an die cytosolische Ca bewerten^{2 +} Konzentration in isolierten Lymphgefäße Ca-Studie^{2 +}-Abhängigen und Ca^{2 +} Sensibilisierend Mechanismen des lymphatischen Kontraktion der glatten Muskulatur.

Abstract

Lymphgefäße aus einem multifunktionalen Transport-System, das Flüssigkeitshomöostase unterhält, liefert Lipide zu den zentralen Kreislauf und wirkt wie ein Überwachungssystem für potenziell schädliche Antigene, die Optimierung der Schleimhaut-Immunität und adaptive Immunantworten ^1. Lymphe ist in der interstitiellen Flüssigkeit, die blind endenden initialen Lymphgefäße eintritt, und dann gegen einen Druckgradienten in größeren Sammlung Lymphgefäße transportiert gebildet. Jeder sammelt lymphatischen besteht aus einer Reihe von Segmenten bezeichnet Lymphangiome gemacht, getrennt durch bicuspid Ventile Rückfluss zu verhindern. Jeder Lymphangione besitzt einen kontraktilen Zyklus, der Lymphe gegen ein Druckgefälle in Richtung der zentralen Kreislauf ² antreibt. Diese phasischen kontraktilen Muster ist analog zu den Herzzyklus mit systolischen und diastolischen Phasen, und mit einem geringeren Rückgang Frequenz ^4. Darüber hinaus generiert lymphatische Tonus der glatten Muskulatur und zeigt myogene Verengung und Erweiterung in Reaktion auf Zu-und Abnahmen in luminalen Druck bzw. ^5. Ein Hybrid aus molekularen Mechanismen, die sowohl die phasischen und tonischen Kontraktilität Lymphgefäße Unterstützung sind daher vorgeschlagen.

Kontraktion der glatten Muskulatur in der Regel durch die cytosolische Ca ^{2 +-Konzentration} reguliert ([Ca ^{2 +]} _i) plus Sensibilität für Ca ^{2 +,} der kontraktilen Elemente in Reaktion auf Veränderungen in der Umgebung der Zelle ^6. [Ca ^{2 +]} _i wird durch die Kombination der Bewegung der Ca ^{2 +} durch Plasmamembran Liganden oder spannungsgesteuerten Ca ^{2 +-Kanäle} und die Freisetzung und Aufnahme von Ca ^{2 +} aus dem internen Speicher bestimmt. Cytosolischen Ca ^{2 +} bindet an Calmodulin und aktiviert Enzyme wie Myosin Light Chain (MLC)-Kinase (MLCK), die wiederum phosphoryliert MLC führt zu Aktin-Myosin-vermittelte Kontraktion ^8. Allerdings ist die Sensitivität dieses Weges zu Ca <sup> 2 + kann durch die MLC-Phosphatase (MLKP) ⁹ geregelt werden. MLCP Aktivität wird durch Rho-Kinase (ROCK) und der Myosin-Phosphatase-Inhibitors Protein CPI-17 geregelt.

Hier stellen wir eine Methode, um Veränderungen in auszuwerten [Ca ^{2 +]} _i im Laufe der Zeit in isolierten, perfundierten Lymphbahnen um Ca ^{2 +-abhängige} und Ca ^{2 +-sensibilisierende} Mechanismen des lymphatischen Kontraktion der glatten Muskulatur zu studieren. Die Verwendung von isolierten Ratten mesenterialen sammeln Lymphbahnen wir untersucht stretch-induzierten Veränderungen in [Ca ^{2 +]} _i und kontraktile Aktivität. Die isolierten Lymph-Modell bietet den Vorteil, dass Druck, Durchfluss, und die chemische Zusammensetzung der Badlösung eng kontrolliert werden kann. [Ca ^{2 +]} _i wurde durch das Laden Lymphgefäße mit dem ratiometrisch, Ca ^{2 +-bindenden} Farbstoff Fura-2 bestimmt. Diese Studien werden einen neuen Ansatz für die breitere Problem der Untersuchung der verschiedenen molekularen Mechanismen, die phasischen regulieren bietenKontraktionen im Vergleich Tonic Verengung in lymphatischen glatten Muskulatur.

Protocol

1. Animals Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss am Louisiana State University Health Sciences Center genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des National Institute of Health (NIH Publikation Nr. 85-12, revised 1996) durchgeführt. Männliche Sprague-Dawley Ratten (Charles River Laboratories, 270-350 g Körpergewicht wt) wurden in einer kontrollierten Temperatur (22 ° C) und kontrollierte Ausleuchtung (12:12 h Licht-Dunkel-Zyklus) Umgebung unterg…

Discussion

Eine neuartige Kombination von Methoden wurde eingesetzt, um innere Pumpen von Lymphgefäßen zu studieren. Die Fähigkeit, gleichzeitig zu messen Veränderungen in [Ca ^{2 +]} _i und Durchmesser in Pumpen Lymphgefäße wird für die Untersuchung der relativen Beiträge der Ca ^{2 +-abhängige} und Ca ^{2 +-sensibilisierende} Signalwege in der gesamten Mechanismus für die lymphatischen kontraktilen Zyklus. Zulassen

Das lymphatische kontraktilen Zyklus beste…

Materials

<tdChemical

1. Ringer 5x Stock
Company	Catalog Number	Amount
Sodium Chloride	EMD	SX0420-3	35 g
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040	1.75 g
Calcium Chloride	Sigma	C-3881	1.47 g
Magnesium Sulfate	Sigma	M-9397	1.44 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
2. MOPS buffer
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
MOPS	Sigma	M3183	125.6 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
3. Albumin Physiological Salt Solution (APSS)
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
Ringer stock (5x)	N/A	N/A	200 mL
Mops Buffer	N/A	N/A	5 mL
Sodium Phosphate	Sigma	S-9638	0.168 g
Sodium Pyruvate	Sigma	P5280	0.22 g
EDTA sodium salt	Sigma	ED2SS	0.0074 g
Glucose	Sigma	G7528	0.901 g
Albumin, Bovine	USB	10856	10 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Adjust pH to 7.4 at 37° C, then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C.

Table 1. Specific Reagents Used. Store all at 4 °C.