Misura della Ca citosolico 2 + In isolati Linfatici contrattile

Summary

Vi presentiamo un approccio per valutare la Ca citosolico<sup> 2 +</supConcentrazione> a linfatici isolato per studiare Ca^{2 +}-Dipendente e Ca^{2 +}-Sensibilizzante meccanismi della contrazione muscolare liscia linfatico.

Abstract

Vasi linfatici comprende un sistema multifunzionale di trasporto che mantiene l'omeostasi dei fluidi, fornisce i lipidi alla circolazione centrale, e agisce come un sistema di sorveglianza per gli antigeni potenzialmente dannosi, ottimizzando l'immunità mucosale e la risposta immunitaria adattativa ^1. La linfa è formata da liquido interstiziale che entra linfatici iniziali cieco-ended, e poi viene trasportata contro un gradiente di pressione in grandi vasi linfatici di raccolta. Ogni linfatico raccolta è costituita da una serie di segmenti chiamati lymphangions, separati da valvole bicuspide che impediscono il riflusso. Ogni lymphangion possiede un ciclo contrattile che spinge linfa contro un gradiente di pressione verso la circolazione centrale ^2. Questo modello contrattile fasica è analogo al ciclo cardiaco, con fasi sistolica e diastolica, e con un ⁴ contrazione minore frequenza. Inoltre, il muscolo liscio linfatico genera tono e visualizza la costrizione e la dilatazione miogenica in risposta ad aumenti e diminuzioni della pressione luminale, rispettivamente ^5. Un ibrido di meccanismi molecolari che supportano sia la contrattilità fasica e tonica dei vasi linfatici sono quindi proposti.

Contrazione della muscolatura liscia è generalmente regolata dal Ca ^{2 +} citosolico concentrazione ([Ca ^{2 +]} _i) più sensibilità al Ca ^{2 +,} degli elementi contrattili in risposta ai cambiamenti nell'ambiente che circonda la cellula ^6. [Ca ^{2 +]} _i è determinato dalla combinazione del movimento di Ca ^{2 +} attraverso la membrana plasmatica legante o tensione gated canali Ca ^{2 +} e il rilascio e l'assorbimento di Ca ^{2 +} dalle riserve interne. Citosolico di Ca ^{2 +} si lega alla calmodulina e attiva gli enzimi come la catena leggera della miosina (MLC) chinasi (MLCK), che a sua volta fosforila MLC porta alla actina-miosina-mediata contrazione ^8. Tuttavia, la sensibilità di questa via di Ca <sup> 2 + può essere regolata dalla fosfatasi MLC (MLCP) ^9. MLCP attività è regolata da Rho chinasi (ROCK) e l'inibitore della proteina fosfatasi miosina CPI-17.

Qui vi presentiamo un metodo per valutare le variazioni [Ca ^{2 +]} _i nel tempo isolato, linfatici perfuso al fine di studiare Ca ^{2 +-dipendente} e Ca ^{2 +-sensibilizzante} meccanismi della contrazione muscolare liscia linfatico. Utilizzando isolato linfatici mesenterica di ratto raccolta abbiamo studiato tratto cambiamenti indotti in [Ca ^{2 +]} _i e l'attività contrattile. Il modello linfatico isolato offre il vantaggio che la pressione, flusso, e la composizione chimica della soluzione bagno può essere strettamente controllati. [Ca ^{2 +]} _i è stato determinato dal carico linfatico con il raziometrici, Ca ^{2 +-binding} dye Fura-2. Questi studi forniranno un nuovo approccio al problema più ampio di studiare i diversi meccanismi molecolari che regolano fasicacontrazioni tonico contro costrizione nel muscolo liscio linfatico.

Protocol

1. Animali Tutte le procedure sono state approvate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa alla Louisiana State University Health Sciences Center e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del National Institute of Health (NIH pubblicazione n ° 85-12, riveduta nel 1996). Maschi Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, 270-350 g di peso corporeo) sono stati alloggiati in una temperatura controllata (22 ° C) e l'illuminazione controllata (12:12 h ciclo di luce scura) ambi…

Discussion

Una nuova combinazione di metodi è stato impiegato per lo studio intrinseco di pompaggio dei vasi linfatici. La possibilità di misurare simultaneamente i cambiamenti in [Ca ^{2 +]} _i vasi linfatici e del diametro di pompaggio permetterà di studi sul contributo relativo di Ca ^{2 +-dipendente} e Ca ^{2 +-sensibilizzanti} vie di segnalazione nel meccanismo generale che regolano il ciclo contrattile linfatico.

Il ciclo linfatico contrattile costituito da co…

Materials

<tdChemical

1. Ringer 5x Stock
Company	Catalog Number	Amount
Sodium Chloride	EMD	SX0420-3	35 g
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040	1.75 g
Calcium Chloride	Sigma	C-3881	1.47 g
Magnesium Sulfate	Sigma	M-9397	1.44 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
2. MOPS buffer
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
MOPS	Sigma	M3183	125.6 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C
3. Albumin Physiological Salt Solution (APSS)
Chemical	Company	Catalog Number	Amount
Ringer stock (5x)	N/A	N/A	200 mL
Mops Buffer	N/A	N/A	5 mL
Sodium Phosphate	Sigma	S-9638	0.168 g
Sodium Pyruvate	Sigma	P5280	0.22 g
EDTA sodium salt	Sigma	ED2SS	0.0074 g
Glucose	Sigma	G7528	0.901 g
Albumin, Bovine	USB	10856	10 g
Sterile Filtered Water	N/A	N/A	Bring to 1 L
Adjust pH to 7.4 at 37° C, then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C.

Table 1. Specific Reagents Used. Store all at 4 °C.